嗜水气单胞菌毒力基因的研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas),为人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中,是多种水产动物的主要致病菌。国内外学者对其进行了许多研究,现普遍认为嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒素密切相关。随着分子生物技术的发展,已有许多学者从分子水平上对嗜水气单胞菌进行了研究,为阐明嗜水气单胞菌的致病机理提供了一些理论依据,并建立起针对几种主要毒力因子的检测手段。本文将嗜水气单胞菌目前的研究策略、部分主要毒力因子及其检测手段作一综述,以期为嗜水气单胞菌致病机理的研究及嗜水气单胞菌病的防治提供参考和借鉴。       

嗜水气单胞菌国内分离株的毒力因子分布与致病性相关性分析

为了研究分析国内致病性嗜水气单胞菌的毒力因子的分布及与致病性的相关性及其防治,选取5种主要毒力因子气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、丝氨酸蛋白酶(ahpA)、抗金属蛋白酶(ast)、肠毒素(altA)设计5对特异性引物,用PCR方法进行检测,采用急性毒性实验方法测定菌株对异育银鲫的半数致死量(50%lethal dose,LD50),细菌药物敏感试验纸片扩散(K-B)法检测对抗生素的敏感性,结果显示:除菌株Hong12的LD50约为109 cfu,毒力弱外,其他毒力均较强,LD50均在106 cfu左右。aerA、ahpA、hlyA、altA、ast 5种毒力基因的携带率分别为77.8%、88.9%、100%、100%、77.8%。通过比较嗜水气单胞菌毒力基因的分布情况与其对鲫鱼致病性试验结果可以发现,aerA、ahpA为嗜水气单胞菌致病的主要毒力因子,与致病性存在相关性,ast与致病力存在一定相关性,但不是主要毒力因子,hlyA、altA与致病性不存在相关性。9株嗜水气单胞菌对青霉素、羧苄青霉素、万古霉素不敏感,对复合磺胺、头孢噻肟、利福平中毒敏感,对呋喃妥因、氯霉素、四环素、氧氟沙星高度敏感。     

嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性研究

为了解嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性,对传代前后嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,A.hydrophila)的毒力和毒力基因进行测定和检测.采用急性毒性试验方法测定10株嗜水气单胞菌原代、第10代及第20代的菌株对异育银鲫(Carassais auratus gibebio)的半数致死量,通过聚合酶链式反应(PCR)检测原代、第10代及第20代的菌株中5种毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA及ast的变化情况.试验结果表明,嗜水气单胞菌在传代过程中毒力基因分布相对较稳定.但是ahpA基因极易发生变异,在培养基上连续多次传代后,毒力逐渐减弱甚至消失.可推知,ahpA基因与毒力相关性最大,并易受传代影响.     

嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性。基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要。目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少。[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因和16S rRNA基因特异性片段(5个基因片段)的多重PCR快速检测方法。[方法]采用选择性RS (Rimler-Shotts)培养基对样品中嗜水气单胞菌有效富集分离和辨认,建立并优化嗜水气单胞菌16S rRNA、ast、alt、aerA、act这5个基因的多重PCR方法,比较菌落PCR中DNA模板不同提取方法对多重PCR扩增结果的影响,并检测该方法对维氏气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌的特异性。[结果]通过对RS培养基上单菌落的16S rRNA基因鉴定,初步判定嗜水气单胞菌和其他可培养菌的菌落形态,对其富集程度进行可视化辨别。多重PCR反应体系优化结果显示,引物浓度最优配比为16S rRNA:ast:alt:aerA:act=1:2:2:3:4。菌落PCR结果显示,...     

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。     

嗜水气单胞菌外膜囊泡组分及功能分析

嗜水气单胞菌是一种鱼类常见的致病菌,且每年养殖业因感染该菌所造成的损失不也计其数。据研究表明,细菌的外膜囊泡具有免疫保护功能,然而目前对嗜水气单胞菌OMVs组分及其功能的研究还鲜有报道。故本研究首次分离纯化得到嗜水气单胞菌分泌的OMVs,然后利用其免疫小鼠的血清进行抑菌实验,结果表明抗OMVs血清具有良好的抑菌效果。为了进一步了解嗜水气单胞菌的OMVs蛋白的特性,本研究通过利用蛋白质组学技术对其蛋白组分进行分析。经结果分析共鉴定到191个蛋白,包括外膜蛋白、脂蛋白、胞浆蛋白等;并涉及细菌氧化还原作用、跨膜转运与生物学合成等多种重要的生物学功能和过程。此外,还有一些如外膜蛋白Omp A等的毒力因子蛋白的发现,都为日后蛋白相关疫苗的研制提供了候选储备。通过本研究,我们更全面地了解嗜水气单胞菌外膜囊泡的生物学功能,不仅有助于筛选具有重要免疫保护性的蛋白,也为研制嗜水气单胞菌的相关疫苗奠定了研究基础。     

翘嘴鳜病原嗜水气单胞菌分子特征及LAMP检测方法的建立

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种危害鳜鱼养殖生产的重要病原细菌, 为进一步明确该病原菌的分子特征及建立快速检测技术, 实验对引起翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌进行了致病性、菌株毒力特征研究, 同时以嗜水气单胞菌气溶素基因aerA为分子靶标设计引物, 利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法。结果表明, 本次引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌半致死浓度为1.6×106 CFU/mL, 携带aerA等14种毒力基因, 此14种毒力基因可用于其致病性分析及分子检测。以气溶素基因aerA设计引物进行的环介导恒温扩增, 结果显示可扩增出阶梯状条带, 加入SYBR Green I染色后呈现绿色的阳性反应, 而对照组均未出现任何扩增条带且反应体系呈现橙色, 表明LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌检测具有很好的特异性; 灵敏度检测的最低检测限为4.6×101 CFU/mL; 10种经人工感染的淡水养殖鱼虾组织匀浆增菌液, 提取DNA后进行LAMP方法检测, 结果均可获得阳性扩增结果, 而对照未染菌组呈阴性, 表明该方法具有较好的应用性, 可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测。     

白藜芦醇抑制嗜水气单胞菌毒力作用研究

为探索白藜芦醇(Resveratrol, Res)在水产动物细菌病防控中的应用价值, 实验以淡水养殖中重要的细菌病原嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为研究对象, 通过设置药物浓度梯度, 检测其对嗜水气单胞菌生长、生物膜形成和溶血活性的抑制作用, 和对毒力及群感调控系统相关基因表达的影响; 同时通过人工感染异育银鲫(Carassius auratus gibelio)试验检测其对鱼体保护作用和对鱼体炎症相关因子基因表达的影响。结果显示: 白藜芦醇对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)>1024 μg/mL; 浓度低于64 μg/mL时, 对菌株生长影响不显著; 浓度≥32 μg/mL时, 对病原菌株生物膜形成和溶血活性具有显著抑制作用(P<0.05), 且随剂量增加而增强。荧光定量RT-PCR结果分析发现白藜芦醇能引起嗜水气单胞菌群感调控系统中luxR和luxS基因分别显著上调和下调表达; 外膜蛋白基因omp表达显著下降。人工感染试验发现攻毒前两小时腹腔注射25、50和100 mg/kg白藜芦醇处理组的异育银鲫死亡率显著下降, 鱼体炎症相关的肿瘤坏死因子(TNF-α)和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)的mRNA表达量也显著下降。研究表明药用植物大黄、虎杖等所含白藜芦醇成分能有效抑制嗜水气单胞菌毒力, 降低鱼体炎症反应的功效; 腹腔注射25—100 mg/kg白藜芦醇对感染病原菌的异育银鲫有一定保护作用。     

西伯利亚鲟源嗜水气单胞菌致病菌的分离及其全菌苗的免疫效果

从患细菌性败血症的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的体内分离到一株致病菌株X1,其对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 cfu/ml,具有较强毒力;经ATB细菌鉴定仪生理生化鉴定和16SrDNA序列分析,菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);其系统发育分析表明,菌株X1与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号:X74676.1)的亲缘关系最近,其同源性为99%.用0.30%福尔马林灭活,将菌株X1制成灭活全菌苗,对西伯利亚鲟进行注射免疫.研究结果表明,嗜水气单胞菌X1全菌苗能够明显提高西伯利亚鲟的血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶含量,而且在嗜水气单胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐剂,有利于进一步增强西伯利亚鲟血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶含量.此外,嗜水气单胞菌X1全菌苗对西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌X1人工感染也具有较好的免疫保护作用,其对西伯利亚鲟的免疫保护率为50%,而且在嗜水气单胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐剂,嗜水气单胞菌X1全菌苗对西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌X1人工感染的免疫保护作用更好,其对西伯利亚鲟的免疫保护率为70%.因此,将嗜水气单胞菌X1全菌苗用于西伯利亚鲟细菌性败血症的防治具有广阔的发展前景.     

2011年通州区腹泻源性嗜水气单胞菌的分子分型特征

目的了解北京市通州区2011年腹泻患者粪便中分离到的27株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的生物学和分子分型特征,为该菌引发疾病的防控提供参考依据。方法对27株腹泻源性嗜水气单胞菌进行Aer毒素检测和PFGE分型,并进行同源性比较。结果27株腹泻源性嗜水气单胞菌中7株菌的Aer毒素为阳性,占总数的25．93％;PFGE图谱分为27个带型。结论在通州区腹泻患者粪便中检出的菌株部分携带Aer毒力因子,目前无优势流行菌株。建议相关部门加强对该菌的监测,避免该菌引发的各类疾患的发生。     

山姜素对鱼源耐药性嗜水气单胞菌体外抗菌作用的研究

旨为探究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的体外抑菌效果及其作用机制。通过测定山姜素对嗜水气单胞菌生长、细菌形态、电导率、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白质代谢和DNA的影响,研究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的抑菌机制。山姜素对5株鱼源耐药性嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为128-256μg/mL和512-1024μg/mL。与对照组相比,2MIC山姜素作用于嗜水气单胞菌CW株8 h、16 h后,菌体皱缩,细胞壁和细胞膜破损,细胞质丢失,内部空化;作用2 h后,菌悬液电导率、乳酸脱氢酶含量、DNA外渗量分别增长了3.97%、26.09%和10.50μg/mL;作用2、4和8 h后,菌悬液核酸荧光强度和密度呈现随时间降低的趋势。山姜素对嗜水气单胞菌的体外抑菌机制为损伤菌体的细胞壁、增加细胞膜的通透性来抑制其生长繁殖。     

一种检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的四重PCR法

建立一种快速诊断致病性嗜水气单胞菌的PCR法。根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、外膜蛋白、溶血素及丝氨酸蛋白酶基因设计4对引物,经PCR反应条件优化后进行检测。结果表明,仅嗜水气单胞菌呈阳性,其检测敏感性高,可检测100 fg的DNA模板。20株大鲵源嗜水气单胞菌经四重PCR法检测时,有18株呈阳性。其中,毒力基因种类较多的阳性菌株经人工感染试验和胞外产物活性检测时显示出较高的致病性。利用该PCR法进行的其他检测中,还发现33份人工感染样本全部呈阳性,34份疑似样本有21份呈阳性,说明四重PCR法可应用于临床检测。本研究建立的四重PCR法具有高度敏感性和特异性,可用于嗜水气单胞菌快速诊断。     

嗜水气单胞菌侵袭力与宿主细胞信号转导和骨架的关系

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是淡水鱼暴发性败血症的主要病原,该菌能够引致淡水鱼等的败血症和人的腹泻等^[1]。嗜水气单胞菌有多种致病因子,如毒素、蛋白酶、S层蛋白等^[2],还发现它具有侵袭作用,有报道嗜水气单胞菌粪分离株能侵袭HEp-2细胞^[3],但对于鱼源菌株的侵袭特性知之甚少。仅有一些报道认为嗜水气单胞菌能引致细胞病变^[4,5]。     

多个环境因素对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响

采用正交试验L16(4×213)设计检验了养殖环境中多种理化因子(温度、p H、分子氨、亚硝酸盐)对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响。试验设立温度(A)4个水平(20、24、28、32℃);p H(B)2个水平(6.5、8.0);分子氨(C)2个水平(0.02、0.04 mg·L-1)和亚硝酸盐(D)2个水平(0.1、0.3 mg·L-1),每组试验鱼分别注射嗜水气单胞菌106CFU·m L-1;以试验鱼存活时间的长短判断嗜水气单胞菌对团头鲂致病力的大小。结果表明:分子氨与p H的交互作用(B×C)和温度(A)因素分别对嗜水气单胞菌致病力影响极其显著(FF0.01),p H(B)对嗜水气单胞菌致病力影响显著(FF0.05),而亚硝酸盐(D)和分子氨(C)对嗜水气单胞菌致病力的影响不显著;团头鲂存活时间y(单位为h)与环境因子间的多元线性回归方程为y=164.713-6.399A+14.367B-11.914(B×C);根据该线性回归方程,当温度为20℃、p H=8.0、分子氨浓度为0.02 mg·L-1时,嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力最弱,鱼体的存活时间最长(149.76 h)。本实验结果可为团头鲂养殖中的嗜水气单胞菌出血病防控预警提供一定的参考。     

大黄醇提物对嗜水气单胞菌抑菌活性及其机制

研究大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌活性及机制。主要采用牛津杯法和液体倍比稀释法;通过扫描电镜、SDS-PAGE、二维电泳及串联质谱等方法探讨大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌机制。结果显示,大黄醇提取物对嗜水气单胞菌有明显的抑制效果,抑菌圈为(24.5±0.2)mm,MIC和MBC均为3.91 mg/m L;在药物作用下,菌体表面变粗糙,细胞膜受损并出现破裂;在经药物处理4 h后,细菌蛋白含量明显下降(P0.05),2-DE电泳发现3个差异性蛋白。结果表明,大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑制作用机制是破坏其细胞膜结构及影响特定蛋白的表达。     

水产品中嗜水气单胞菌耐药性研究进展

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila具有广泛的致病性,是水生动物最常见的致病菌之一。由于抗生素不合理使用、质粒以及耐药基因的水平转移等因素,来自零售市场、超市和餐厅的即食海鲜产品中,均可分离出大量的嗜水气单胞菌耐药菌株及其耐药基因。因此,探明关键控制点、寻求有效缓解抗生素耐药性的防控策略至关重要。文中介绍了我国嗜水气单胞菌的耐药现状,嗜水气单胞菌的主要侵染及耐药机制,以及目前削减和防控耐药性的主要手段和策略,并对水产品耐药性研究方向和重点作出展望。     

嗜水气单胞菌感染现状及耐药分析

目的调查湖州市中心医院嗜水气单胞菌感染现状和耐药情况。方法采用常规方法分离,用VITEK-32全自动微生物分析仪进行菌种鉴定为嗜水气单胞菌或豚鼠气单胞菌,依据葡萄糖产气反应鉴定为嗜水气单胞菌。并根据配套药敏卡进行药敏试验。结果共分离到34株嗜水气单胞菌,主要来自痰液、胆汁、腹腔引流液或腹水。嗜水气单胞菌对哌拉西林、替卡西林、阿莫西彬克拉维酸、妥布霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方新诺明耐药率为52．9％～73．5％。结论目前嗜水气单胞菌也呈现多重耐药现象,临床上应予以重视。     

和厚朴酚对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为了研究不同浓度和厚朴酚对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)致病力的影响, 筛选抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物, 通过溶血试验、免疫印记试验、荧光定量PCR试验和动物试验进行了研究。结果发现, 和厚朴酚能在亚抑菌浓度下降低嗜水气单胞菌培养物上清中的溶血活性; 蛋白免疫印迹试验发现和厚朴酚能降低嗜水气单胞菌气溶素的分泌; 荧光定量PCR试验进一步表明和厚朴酚与嗜水气单胞菌共培养后降低了气溶素编码基因aerA的转录而降低气溶素的分泌。此外, 通过动物试验发现和厚朴酚治疗能显著提高斑点叉尾鮰( Ictalurus punctatus )嗜水气单胞菌感染模型的存活率。以上研究表明, 和厚朴酚能通过降低气溶素编码基因aerA的转录而降低嗜水气单胞菌的致病力, 和厚朴酚是一种潜在的新型抗嗜水气单胞菌感染的先导化合物。     

CP7抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理

[目的]研究多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理,为防治嗜水气单胞菌引起的鱼病提供新的潜在天然药物.[方法]采用抑菌试验、钼锑抗比色法和紫外光谱法研究其对嗜水气单胞菌S12菌株生长、磷泄漏和生物大分子的影响,并利用扫描电镜和透射电镜观察了嗜水气单胞菌细胞结构遭受的破坏作用.[结果]CP7ACP对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径约8.1 mm,最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)分别为原液浓度的1/8和1/4;嗜水气单胞菌受CP7ACP处理后,电镜观察发现其细胞壁、细胞膜、细胞器以及菌体均受到不同程度的破坏,胞内的生物大分子和磷泄漏明显,基因组DNA发生增色效应.[结论]CP7ACP抑制嗜水气单胞菌生长,可用于防治嗜水气单胞菌引起的鱼病.     

几种中药单体和抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性研究

考察没食子酸等6种中药单体和诺氟沙星等3种抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性及其联合抑菌作用。通过琼脂扩散法测定受试物的抑菌作用,用微量二倍稀释法测定受试物最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,用棋盘法考察受试物的联合抑菌作用。6种中药单体中没食子酸和槲皮素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌抑制作用较强,抑菌圈均达到20 mm以上,没食子酸对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的MIC和MBC均为250 g/mL;槲皮素对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为500 g/mL,对温和气单胞菌的MIC和MBC分别为250和500 g/mL;而大黄素甲醚等4种中药单体无明显的抑菌作用。嗜水气单胞菌及温和气单胞菌对诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考等抗生素均极敏感。在联合药敏试验中,没食子酸与恩诺沙星或氟苯尼考、槲皮素与氟苯尼考联合用药对嗜水气单胞菌具有相加抑菌作用;没食子酸与恩诺沙星联合用药对温和气单胞菌具有协同抑菌作用,没食子酸与诺氟沙星或氟苯尼考、槲皮素与氟苯尼考联合用药对温和气单胞菌具有相加抑菌作用。没食子酸和槲皮素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌具有显著的抑制作用,二者与恩诺沙星、诺氟沙星、氟苯尼考等抗生素联合应用具有相加或协同作用,有助于降低抗生素的用量及残留。