茶小绿叶蝉成虫唾液细菌蛋白的鉴定

【目的】通过鉴定茶小绿叶蝉Empoasca flavescens成虫水状唾液蛋白中的细菌蛋白,解析叶蝉唾液的细菌种类。【方法】利用自制的收集装置和Parafilm膜夹营养液法对叶蝉成虫唾液进行收集,经超滤浓缩和电泳分离后,使用膜辅助样品制备技术法(filter-aided sample preparation, FASP)酶解,借助液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测蛋白,利用Mascot 2.2软件比对UniProt的细菌蛋白数据库进行查库分析从而鉴定唾液中的细菌蛋白。【结果】共鉴定到27个目49种细菌的142种蛋白。以变形菌门(Proteobacteria)细菌蛋白为主,共107个蛋白,其中又以α-变形菌纲(α-Proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)细菌蛋白占比最多。其次为厚壁菌门(Firmicutes)细菌蛋白,共28个蛋白,分别属于杆菌纲(Bacilli)和梭菌纲(Clostrida),这些蛋白参与氨基酸、维生素和能量代谢等。【结论】鉴定的细菌蛋白可能是叶蝉生活史的重要参与者。本研究为进一步研究共生菌、茶小绿叶蝉和茶树之间的关系提供基础信息。     

基于高通量测序的褐飞虱肠道微生物多样性分析

【目的】探明褐飞虱Nilaparvata lugens成虫肠道微生物群落结构和多样性。【方法】分离褐飞虱成虫完整肠道并提取总DNA,利用Illumina MiSeq(PE300)技术对其肠道细菌16S rRNA的V3-V4变异区和真菌ITS2序列进行测序,统计肠道微生物的操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)数量,分析其物种组成、丰度及Alpha多样性。并通过qPCR技术验证随机挑选注释到的4种肠道菌的高通量测序数据的有效性。【结果】分别获得褐飞虱成虫肠道细菌16S rRNA和真菌ITS2优质序列32 395和24 986条,根据序列相似性进行聚类分析分别获得235和128个OTUs。其中,细菌共注释到7个门, 15个纲, 26个目, 45个科和73个属;真菌共鉴定到3个门, 9个纲, 12个目, 15个科和18个属。在门分类水平上,细菌以变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势门类;真菌以子囊菌门(Ascomycota)为绝对优势菌门。在属分类水平上,细菌的优势属为不动杆菌属Acinetobacter以及紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)未确定属和毛螺菌科(Lachnospiraceae)未确定属,其丰度分别为36.37%, 17.22%和15.01%;真菌的优势属为粪壳菌纲(Sordariomycetes)未确定属,丰度为95.77%。Alpha多样性分析结果显示,褐飞虱肠道细菌(真菌)的观测物种数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson 指数分别为235(128), 262.64(165.40), 3.90(0.91)和0.62(0.75)。4种肠道菌的qPCR结果显示高通量测序数据具有较高的有效性。【结论】褐飞虱成虫肠道细菌和真菌群落整体多样性比较丰富。研究结果为从共生微生物角度解析褐飞虱的环境适应性以及开发基于微生物防治的新技术等方面提供了依据。     

芽孢杆菌的引入对褐飞虱微生物群和生长发育的影响

【目的】明确褐飞虱Nilaparvata lugens体内可培养共生细菌的种类，探索其中芽孢杆菌类共生菌对褐飞虱微生物群和生长发育的影响。【方法】通过离体培养的方法，从褐飞虱两种不同致害性种群(TN1敏感种群和IR56高致害种群)中分离可培养共生细菌。通过16S rDNA测序对获得的可培养共生菌进行鉴定，在此基础上利用原位杂交研究了共生细菌在褐飞虱体内的分布。利用人工饲料添加抗生素和回补共生细菌的方式，研究了减菌和回补芽孢杆菌的处理对褐飞虱生长发育以及共生菌丰度的影响。比较了通过饲喂和显微注射对芽孢杆菌引入的影响，考察了芽孢杆菌的定殖与褐飞虱TN1种群致害性之间的相关性。【结果】利用离体培养法从褐飞虱中获得了15株不同的共生细菌，其中包括2株源于IR56高致害种群的芽孢杆菌类共生细菌BPH-S36和BPH-S33。原位杂交结果表明共生细菌在褐飞虱成虫唾液腺、肠道、脂肪体和雌虫内生殖器中均有分布，而在雄虫内生殖器中鲜有分布。体内共生细菌对褐飞虱的生长发育至关重要，共生细菌的减少导致褐飞虱存活率在第3和6天时显著下降，而回补共生芽孢杆菌BPH-S36或BPH-S33可使其存活率在第6天时显...     

基于16S rRNA高通量测序的灰飞虱体内细菌群落结构及多样性分析

【目的】探明灰飞虱Laodelphax striatellus体内细菌的群落结构和种类多样性。【方法】采用Illumina MiSeq测序平台对新羽化24 h的灰飞虱雌雄成虫体内细菌16S rRNA的V3-V4变异区序列进行高通量测序,应用USEARCH和Silva等软件和数据库来统计样品序列数目和操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)数量,分析灰飞虱雌雄成虫体内细菌的种类组成、丰度、Alpha多样性及其差异。【结果】灰飞虱雌、雄成虫样本分别获得29 333和25 919条有效序列,根据序列相似性进行聚类分析分别获得55和57个OTUs。其中,雌、雄成虫两类样本共有OTU数目20个,特有的OTU数目分别为35和37个。基于OTU物种分类分析,雌雄成虫样本中细菌种类一共覆盖7个门、15个纲、23个目、33个科、56个属和73个种。在门、纲、目和科分类阶元上,雌雄成虫两类样本均以变形菌门(Proteobacteria,雌99.96%/雄99.16%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,雌97.76%/雄97.84%)、红螺菌目(Rhodospirillales,雌83.92%/雄53.21%)和醋酸杆菌科(Acetobacteraceae,雌83.90%/雄53.17%)中的细菌为优势菌。在属分类阶元上,灰飞虱雌雄成虫体内优势菌为醋酸杆菌科未分类属(unclassified Acetobacteraceae),沃尔巴克氏体属Wolbachia次之,后者在雌、雄成虫体内丰度分别为13.81%和44.52%。在种水平上,灰飞虱雌、雄成虫体内特有细菌分别为21和32个种,但两类样本中性别特有种的丰度普遍极低,均不足0.5%。【结论】灰飞虱雌雄成虫间细菌群落组成和种类多样性存在差异。本研究为进一步挖掘灰飞虱体内关键微生物并解析其生物学功能及其利用等方面奠定了基础。     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

褐飞虱吞蛋白的基因克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】探析吞蛋白(endophilin)在褐飞虱Nilaparvata lugens生长繁殖过程中的作用。【方法】克隆褐飞虱吞蛋白基因,并进行生物信息学分析;在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达褐飞虱吞蛋白基因,融合蛋白经Ni柱亲和层析法纯化后,免疫新西兰兔子,获得相应的多克隆抗体;将所得的抗体用于检测褐飞虱卵巢中吞蛋白的表达和定位。【结果】克隆得到褐飞虱两个吞蛋白基因endophilin A(Endo A)和endophilin B(Endo B),GenBank登录号分别为KY126096和KY126095,分别编码387个和352个氨基酸,都含有吞蛋白典型的BAR结构域和SH3结构域,但它们在结构上存在差异。ELISA和Western blot检测结果表明,制备的兔抗血清效价达1∶1 000 000,并表现出较好特异性。将获得的抗体应用于免疫荧光实验表明,Endo A和Endo B蛋白在褐飞虱卵巢中普遍表达,在卵巢滤泡细胞的细胞间隙、细胞膜、细胞质中广泛分布,而且与脂类物质的分布模式类似,与正在侵入褐飞虱卵巢的类酵母共生菌共定位。【结论】获得了褐飞虱吞蛋白基因Endo A和Endo B序列,并明确了其生物信息学特征,成功制备了Endo A和Endo B多克隆抗体,分析了Endo A和Endo B在褐飞虱卵巢中的表达情况,认为其可能与褐飞虱卵巢发育和成熟以及类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。这些结果为进一步研究Endo A和Endo B在褐飞虱中的生物学功能奠定了基础。     

隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白相互作用及其在褐飞虱发育与生殖中的作用

【目的】在真核生物中验证隐花色素蛋白(Cryptochrome)/铁硫簇蛋白(Iron-sulfur cluster assembly1)的相互作用,研究2种蛋白在褐飞虱Nilaparvata lugens发育和生殖过程中的作用,为二者在磁感受机制中的协同作用及磁场对昆虫生理状态的调控机制提供依据和新的研究方向。【方法】通过酵母双杂交系统对褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白/Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白的相互作用进行验证。在褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi(RNA interference)沉默模型,并采用RT-qPCR检测2个基因沉默效率,统计沉默虫体的若虫历期和产卵量。【结果】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白存在相互作用,而Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白不存在相互作用。褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中成功建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi沉默模型,在注射dsRNA后第2天、第4天和第6天时,2个基因的沉默效率均能达到70%以上。Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因沉默虫体的若虫历期无明显变化,但是产卵量受到显著性抑制。【结论】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白存在相互作用,二者在褐飞虱生殖过程中发挥重要作用。     

褐飞虱成虫不同密度和取食时长胁迫下水稻植株的生理生化响应

【目的】探索褐飞虱Nilaparvata lugens不同密度与取食时长胁迫下水稻植株生理生化响应。【方法】在褐飞虱成虫3个密度(2,4和8头/株)与4个取食时长(6, 24, 48和96 h)的组合处理后，应用生物化学分析方法检测水稻植株中叶绿素(chlorophyll, Chl)与总蛋白(total protein, TP)含量，脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)与多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性。【结果】与对照组(未接种褐飞虱成虫)相比，取食6 h时，低密度(2头/株)褐飞虱成虫引起水稻植株中Chl含量显著降低，TP含量和PPO活性显著升高；高密度(8头/株)褐飞虱成虫引起水稻植株中Chlb和总Chl含量、TP含量及LOX和POD活性显著升高。与对照组相比，取食24 h时，低密度褐飞虱成虫引起水稻植株中Chl含量和PPO活性显著降低，LOX, T-SOD和POD活性显著升高，高密度褐飞虱成虫引起水稻植株中...     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

摘要: 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号: MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8基因NlRPS8的克隆及其表达分析

【目的】核糖体蛋白在生物体内具有重要作用,本研究旨在探明核糖体蛋白S8在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育过程中的表达规律和功能。【方法】本文根据褐飞虱基因表达谱提供的差异表达基因信息及转录组提供的基因核心序列,结合褐飞虱基因组比对分析,对褐飞虱核糖体S8基因进行了预测,并通过RT-PCR获得了褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8的全长c DNA序列,命名为NlRPS8(Gen Bank登录号:KU341337)。【结果】NlRPS8基因全长627 bp,编码208个氨基酸。进化分析表明,褐飞虱与桑粉介壳虫Maconellicoccus hirsutus亲缘关系最为接近。应用荧光定量PCR分析了基因NlRPS8的表达规律,结果表明,NlRPS8基因在褐飞虱怀卵雌虫中表达量最高,而在雄成虫、初羽化雌成虫与1~5龄若虫表达量相对较低;在褐飞虱体内,NlRPS8基因在卵巢中表达量最高,中肠次之,在其他部位表达量较低。在抗性品种ASD7和RHT上,NlRPS8基因表达量分别为感性品种TN1上的1.99倍和2.14倍。NlRPS8基因在经过饥饿处理1 d的褐飞虱组中表达量为正常组的1.6倍。【结论】研究结果显示NlRPS8基因在褐飞虱生长、繁殖中发挥作用,为进一步研究NlRPS8基因在褐飞虱生长发育和对抗性品种适应中的功能提供了线索。     

硫激肽及其受体调控褐飞虱取食行为

【目的】明确硫激肽(sulfakinin, SK)及硫激肽受体(sulfakinin receptor, SKR)在褐飞虱Nilaparvata lugens取食行为中的作用。【方法】PCR克隆褐飞虱硫激肽基因Nlsk及其受体基因Nlskr cDNA全长序列并进行生物信息学分析；利用qRT-PCR检测Nlsk及Nlskr在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、触角、翅、口针、足、肠道和马氏管)中的表达量；褐飞虱3龄若虫注射dsNlskr进行基因沉默，qRT-PCR检测4龄若虫中Nlskr的表达量，测定4龄若虫的取食量；基于已构建的Nlskr RNAi后的4龄若虫转录组数据库进行差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)的GO和KEGG分析以及取食相关基因的qRT-PCR验证。【结果】PCR克隆得到了褐飞虱Nlsk(GenBank登录号：AB817281)及Nlskr(GenBank登录号：BAO01059.1)的cDNA全长序列。序列比对结果显示，褐飞虱NlSK成熟肽具有与其他物种保守的C端FMRFam...     

褐飞虱自噬相关基因NlATG13的表达与功能分析

【目的】自噬参与多种细胞生理过程,自噬相关蛋白ATG13是ATG1/13复合物的组成部分, 在启动自噬中发挥着重要作用。本研究旨在分析ATG13在褐飞虱Nilaparvata lugens中发挥的功能,评估其作为害虫防治靶标的潜力。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用RACE克隆褐飞虱NlATG13的cDNA全长序列;应用生物信息学技术分析NlATG13的核苷酸和氨基酸序列特征。利用RT-qPCR检测其在褐飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫和雌雄成虫)和不同组织(5龄若虫头、胸、中肠和脂肪体以及刚羽化雌成虫的卵巢)中的表达模式。通过显微注射dsNlATG13至3龄若虫进行RNAi敲减NlATG13的表达,探究其对褐飞虱生存和中肠细胞自噬的影响;利用RT-qPCR检测RNAi 4 d时3龄若虫中糖原合成与代谢通路相关基因NlGSK3, NlGS和NlGP的表达量。【结果】克隆得到NlATG13的cDNA全长序列(GenBank登录号: MF805752),其开放阅读框长1 203 bp,编码一个含400个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号: AWW05678.1)。系统发育分析表明,在纳入分析的物种中,NlATG13蛋白与半翅目温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的ATG13蛋白进化关系较为接近。发育表达谱结果表明NlATG13在褐飞虱3和5龄若虫中的表达量显著高于在1-2龄若虫、雌成虫和雄成虫中的; 组织表达谱结果表明NlATG13在5龄若虫头部和脂肪体中的相对表达量较高,在胸部的表达量最低。RNAi结果显示,与dsGFP对照组相比dsNlATG13处理组中褐飞虱中肠细胞中存在明显的糖原颗粒积累,NlGS, NlGSK3和NlGP的表达量均无显著变化,组织ATP含量显著降低;褐飞虱的存活率显著降低,处理第10天时褐飞虱存活率下降到41.4%,而dsGFP对照组的存活率保持在85.6%的较高水平。【结论】 RNA干扰NlATG13基因对褐飞虱的生存和中肠细胞自噬具有显著的抑制效果,NlATG13基因具有作为褐飞虱防治靶标的潜力。     

灰飞虱中IKK相关基因的鉴定及其在水稻条纹病毒侵染中的功能

【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK 1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开放阅读框长2379 bp,编码792个氨基酸;TBK 1开放阅读框长1551 bp,编码516个氨基酸。两个基因编码的蛋白都具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和1个泛素折叠结构域。RT-PCR结果表明,IKKα和TBK 1在无毒灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中均有表达。qRT-PCR分析结果表明,IKKα和TBK 1在RSV侵染后的灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中的表达水平与其在无毒灰飞虱中的表达量之间存在明显差异。进一步将RSV侵染后的灰飞虱3龄若虫中的IKKα和TBK 1干扰后,带毒灰飞虱中的RSV含量显著上升。【结论】本研究结果表明,NF-κB信号途径中的两个重要基因IKKα和TBK 1在灰飞虱中广泛表达,且在灰飞虱抵御RSV的侵入过程中可能具有重要功能。这些结果为今后进一步深入研究NF-κB免疫通路在灰飞虱抗病毒中的功能提供了丰富的基础信息。     

水稻与褐飞虱的相互作用研究进展

褐飞虱(Nilapavata lugens,brown planthopper,BPH)是水稻生产中最重要的害虫.水稻与褐飞虱互作机制的研究为培育新的水稻品种做出了贡献.本文综述了栽培稻和野生稻中分离定位的抗褐飞虱基因,以及褐飞虱唾液蛋白、水稻和褐飞虱代谢物和褐飞虱共生菌在水稻-褐飞虱互作关系中的作用.目前从栽培稻和野生稻中鉴定了 40个抗褐飞虱基因,褐飞虱取食的信号转导开启水稻抗性基因的表达和防御机制的改变,包括筛管封闭、次生代谢产物的产生,以及蛋白酶抑制剂的诱导等.褐飞虱的唾液蛋白以及体内存在多种共生微生物对褐飞虱的生长发育和适应抗性都起到一定作用,但目前提出的水稻-褐飞虱分子相互作用的模型仍有许多方面有待研究.     

携带松材线虫对松墨天牛成虫肠道和气管细菌的影响

【目的】探究被松墨天牛Monochamus alternatus携带的松材线虫Bursaphelenchus xylophilus对松墨天牛肠道和气管细菌的影响。【方法】野外采集携带松材线虫的松墨天牛成虫后,取出完整肠道和气管进行细菌总DNA抽提后进行16S rDNA基因测序并拼接,并利用生物信息学方法分析松墨天牛成虫肠道和气管细菌组成、结构、丰度和多样性。【结果】携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道和气管细菌菌群共检测到15门26纲66目110科201属296种,可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)数目为444。携带松材线虫的松墨天牛成虫比未携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道优势细菌菌群变化不显著,均为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌目(Enterobacterales);携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为变形菌门肠杆菌目,未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为厚壁菌门(Firmicutes)乳杆菌目(Lactobacillales)。携带松材线虫的松墨天牛成虫较未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管细菌多样性和丰度升高,细...     

转Bt基因水稻“赣绿1号”对非靶标害虫褐飞虱取食、产卵行为及生长发育的影响

【目的】研究转cry1Ab/Ac基因水稻"赣绿1号"对非靶标害虫褐飞虱Nilaparvata lugens的潜在影响。【方法】采用标准苗期集团筛选法研究"赣绿1号"对褐飞虱的抗性;利用取食和产卵选择性研究"赣绿1号"对褐飞虱取食、产卵行为的影响;用"赣绿1号"连续饲养褐飞虱5代,研究对褐飞虱生长发育(若虫发育历期、成虫体重)和繁殖(孵化子代若虫数量)的影响。【结果】"赣绿1号"与非转基因亲本对褐飞虱均表现为中抗;褐飞虱于"赣绿1号"上取食、产卵选择与非转基因亲本均无显著差异;除取食"赣绿1号"第2代褐飞虱第3龄龄期显著短于取食非转基因亲本水稻的褐飞虱外,第2代和第5代若虫各龄龄期均无显著差异,褐飞虱雌雄成虫体重和孵化若虫数均无显著差异。【结论】与对照水稻相比,转Bt基因水稻"赣绿1号"对非靶标害虫褐飞虱的苗期抗性、取食、产卵行为及生长发育等无明显的不利影响。     

褐飞虱体内共生菌多样性研究进展

褐飞虱体内存在大量的共生菌,这些共生菌不但具有种类多样性,同时在对寄主的功能上也存在多样性。目前利用分子生物学手段以及高通量测序技术鉴定得到的测序丰度大于0.1%的共生真菌和共生细菌种类分属19和53个不同的属。由于技术的局限性和共生菌难以离体培养的特性,仍有相当部分共生菌分类地位尚未明确。共生菌在褐飞虱的生长、发育、繁殖、营养代谢、抗性变异以及免疫功能等生命活动中起着至关重要的作用,种类丰富的共生菌发挥着不同的功能。共生真菌主要参与固醇类物质和必需氨基酸的合成,而共生细菌则主要参与维生素的合成。共生菌在褐飞虱致害性变异、抗药性发展以及对宿主的繁殖等方面也都产生了重要的影响,但是具体的分子机制尚未明确。本文针对褐飞虱体内共生菌多样性研究概况进行综述,并对今后的研究侧重点提出了建议,后续研究可以聚焦于: (1)共生菌种类的鉴定;(2)特定、单一种类共生菌的功能;(3)共生菌在褐飞虱体内各组织间的扩散途径、扩散种类和调控机制;(4)以共生菌为靶标进行褐飞虱的防治等。     

褐飞虱磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基基因NlPIK3R1的克隆与功能分析

【目的】PI3K信号通路在生物体中发挥重要功能,涉及糖和脂质的代谢、细胞和组织生长以及生物个体寿命等。本研究旨在探明该通路中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在褐飞虱Nilaparvata lugens中的功能。【方法】根据转录组提供的PI3K p85α核心序列信息,应用c DNA末端快速克隆的技术(RACE)获得了编码PI3K p85α的基因Nl PIK3R1的全长c DNA(Gen Bank登录号为KP635379),并应用荧光定量PCR和通过给成虫喂食ds Nl PIK3R1对Nl PIK3R1进行RNA干扰(RNAi)分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。【结果】荧光定量PCR测定结果表明,Nl PIK3R1在褐飞虱若虫和雄成虫中表达量均较低,但在怀卵雌成虫中大量表达。RNAi结果表明,给褐飞虱成虫喂食0.1和0.5μg/μL ds Nl PIK3R1均导致Nl PIK3R1的表达明显受到抑制,高浓度组的抑制效果尤为明显。喂食ds Nl PIK3R1对褐飞虱成虫具有极显著致死效果,高浓度组的褐飞虱成虫在饲喂第7天时存活率仅为37.5%,相比于空白对照组(87.00%)和ds GFP对照组(76.67%)均达到了极显著差异(P0.01)。对Nl PIK3R1的RNAi导致褐飞虱成虫羽化率下降和体重变轻。【结论】本研究结果显示,Nl PIK3R1基因对褐飞虱的生存、生长和发育具有重要作用,可以作为防治褐飞虱的潜在靶标。