赤拟谷盗TRE基因家族特性及RNAi抑制表达效果分析

分析赤拟谷盗海藻糖酶基因(Trehalase,简称TRE)家族的特性及RNAi介导的TRE基因沉默后的相互作用效果。采用生物信息学和相关软件分析5个海藻糖酶基因序列特征以及二级结构等分子特性并推测其生理功能,用MEGA 6.0软件构建TRE与其它昆虫TRE的系统进化树;采用注射RNAi技术,分别干扰赤拟谷盗海藻糖酶基因mRNA的表达;采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测单个海藻糖酶基因表达抑制后对其它TRE基因mRNA表达的影响。赤拟谷盗4个可溶性海藻糖酶TRE1蛋白相似性高,具有类似的二级结构,即含有相似比例的α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲,膜结合型海藻糖酶TRE2与TRE1在蛋白质的二级结构上差异较大;系统进化树分析表明赤拟谷盗的可溶性海藻糖酶与其它昆虫的TRE1聚集在一起,膜结合型海藻糖酶与其它昆虫的TRE2聚集在一起;RNAi实验结果表明单独干扰某个TRE1基因的mRNA表达后,其它3个TRE1基因的表达有的上升,有的下降,而TRE2基因表达都为显著下降;单独干扰TRE2基因表达,则其它4个TRE1基因的表达一致显著下降。赤拟谷盗可溶性TRE1和膜结合型TRE2的二级结构差异较大,单个TRE基因表达被抑制后,其他TRE基因存在连锁抑制或者互补功能。     

褐飞虱两个糖转运蛋白的功能分析及调控海藻糖代谢的影响

海藻糖转运蛋白（Trehalose transporter,Tret）可将昆虫“血糖”——海藻糖由脂肪体转运到血淋巴中,是维持昆虫体内海藻糖平衡的重要转运蛋白。本研究通过对褐飞虱Nilaparvata lugens两条糖转运蛋白序列（NlTret1、NlTret1 X1）进行生物信息学分析,并利用RNAi技术沉默NlTret1与NlTret1 X1基因,探讨其对褐飞虱调控海藻糖代谢的生物学功能。生物信息学分析表明,NlTret1与NlTret1 X1分别有1 353 bp和1 488 bp的开放阅读框,编码具有450和495个氨基酸残基,蛋白分子量大小为49.984 kDa和53.059 kDa,理论等电点pI为6.53和7.46;保守结构域分析NlTret1和NlTret1 X1分别包含10个和12个跨膜结构域,属于MFS超家族;二级结构以及三级结构预测NlTret1和NlTret1 X1主要包含无规卷曲和α螺旋结构。进化树分析显示NlTret1和NlTret1 X1皆与同为半翅目昆虫的Tret1蛋白亲缘关系接近。与注射dsGFP相比RNAi后显著抑制了靶标基因的表达量。荧光定量检测海藻糖代谢通路TRE和TPS基因,结果显示注射dsNlTret1 48 h后NlTRE1-1、NlTPS2基因表达量极显著下调,NlTRE1-2、NlTRE2与NlTPS1、NlTPS3基因表达量极显著上调;而注射dsNlTret1 X1则为NlTRE1-1、NlTRE2与NlTPS1、NlTPS2基因表达量极显著降低,NlTRE1-2和NlTPS3基因表达量极显著增高。注射dsNlTret1与dsNlTret1 X1后海藻糖酶活性均显著性降低,同时NlTret1的沉默显著抑制了糖原含量和海藻糖含量,NlTret1 X1的沉默仅使葡萄糖含量显著增高。褐飞虱两条糖转运蛋白序列经初步分析确定为海藻糖转运蛋白,这两个海藻糖转运蛋白在转运糖类物质中发挥着不同的作用,其中NlTret1 X1可能参与葡萄糖运输功能,而NlTret1则更可能参与海藻糖特异性转运。研究结果有利于探究海藻糖转运蛋白Tret调控海藻糖代谢的作用机制,为将来通过其调控昆虫海藻糖代谢平衡治理褐飞虱等害虫提供理论依据。