猪链球菌2型与宿主细胞体外相互作用研究进展

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一种世界范围内的引起猪链球菌病的重要的人兽共患病原菌,人感染SS2后多呈现败血症型和脑膜炎型。2005年猪链球菌在我国四川省的感染暴发和近年来不断出现的零散病例给我国的公共卫生和食品安全带来了威胁,但迄今为止,对SS2致病机制研究尚不够深入。SS2的致病过程和宿主细胞相互作用密切相关,SS2-体外宿主细胞相互作用模型的建立对于揭示SS2致病分子机理具有重要的意义。目前的研究报道主要是从猪链球菌黏附与侵袭上皮细胞或内皮细胞、猪链球菌抗吞噬细胞的吞噬和猪链球菌激活免疫细胞炎症反应方面研究猪链球菌与宿主细胞的相互作用,但与其他常致病性链球菌如化脓性链球菌和肺炎链球菌相比,有些SS2-体外宿主细胞相互作用模型还缺乏统一的标准,由于感染模型的实验参数不尽相同得到结果也有所不同。本文对近年来猪链球菌2型与宿主细胞体外相互作用及其致病机理研究进展作一综述。     

家蚕BmlncR2036调控P25基因启动子活性及参与中肠发育调控

【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)对家蚕Bombyx mori发育具有重要调控作用。我们在前期研究中发现一个位于家蚕丝素蛋白基因P25附近的lncRNA BmlncR2036。本研究旨在进一步探索BmlncR2036调控家蚕P25基因表达的分子机制。【方法】qPCR检测BmlncR2036在5龄第3天家蚕幼虫不同组织(体壁、脑、神经、精巢、卵巢、丝腺、马氏管、血淋巴、脂肪体和中肠)中和不同发育阶段前丝腺、中丝腺和后丝腺中的表达谱。预测能够同时靶向P25和BmlncR2036的miRNA,利用荧光素酶检测法验证miRNA与P25互作关系。荧光素酶检测法测定BmlncR2036对P25基因启动子转录活性的影响。在家蚕5龄第3天幼虫中注射dsRNA敲低BmlncR2036的表达,观察丝腺及中肠表型的变化。【结果】qPCR结果显示,BmlncR2036在家蚕5龄第3天幼虫和5龄熟蚕的后丝腺中高表达,与P25基因呈现一致的表达趋势;BmlncR2036在家蚕5龄第3天幼虫的精巢和中肠中高表达,在其他组织中表达量较低,暗示其功能的多样性。miR-2739和miR-279a既能够与BmlncR2036匹配,也可能靶向P25基因的3′UTR。但荧光素酶检测法结果显示P25不是miR-2739和miR-279a的真实靶标。BmlncR2036负调控P25启动子活性,共转染pcDNA3.1(+)［BmlncR2036］和pGL3-Enhancer［P25-promoter］载体后,细胞荧光素酶活性极显著下降了52%。在家蚕5龄第3天幼虫中敲低BmlncR2036表达后出现体色变暗,中肠残留大量内容物,直至死亡的现象,表明BmlncR2036可能参与家蚕中肠的发育调控。【结论】发现lncRNA BmlncR2036可调控P25基因启动子活性,还可能参与调控家蚕中肠的发育。本研究为进一步探索家蚕lncRNA的功能提供了实验依据。     

豌豆蚜翅分化相关miRNA及其预测靶基因对蜕皮激素的应答及miR-92a-1-p5靶基因的验证

【目的】蜕皮激素对孤雌蚜翅两型性分化具有重要调控作用。在前期研究中我们发现5个微小RNA(microRNA, miRNA)在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum翅两型性分化中也发挥关键作用,但蜕皮激素是否与miRNA互作参与蚜虫翅型分化未知。本研究旨在探索蜕皮激素对5个miRNA及其预测靶基因表达的影响,揭示蜕皮激素与miRNA协同调控蚜虫翅型分化的机理。【方法】选择5个与豌豆蚜翅两型性分化相关的miRNA (Let-7, miR-92a, miR-92b, miR-92a-1-p5和miR-277),使用0.1 mol/L蜕皮激素类似物20-羟基蜕皮酮(20E)分别处理孤雌生殖豌豆蚜2龄若蚜10 min和30 min,48 h后取样;qPCR检测这些miRNA及其预测靶基因在20E处理后的表达量;利用双荧光素酶活性检测法对miR-92a-1-p5的预测靶基因flightin进行验证;利用纳米载体/变性剂在孤雌生殖豌豆蚜4龄若蚜中敲低miR-92a-1-p5表达,验证miR-92a-1-p5与其预测靶基因flightin的互作关系。【结果】0.1 mol/L 20E处理30 min可极显著诱导孤雌生殖豌豆蚜2龄若蚜5个miRNA的表达;处理10 min则miR-92a-1-p5和miR-92b表达量较对照极显著下降,而Let-7和miR-277较对照极显著上升。Let-7与预测靶基因abrupt在0.1 mol/L 20E处理后孤雌生殖豌豆蚜豌2龄若蚜中表达趋势相反,miR-92a和miR-277的预测靶基因wingless和Uba1在0.1 mol/L 20E处理10 min时表达量极显著下降,与两个对应的miRNA表达趋势相反;miR-92a-1-p5的预测靶基因flightin在0.1 mol/L 20E处理30 min后表达量极显著下降,与miRNA表达趋势相反。双荧光素酶活性检测结果显示,共转染miR-92a-1-p5模拟物和flightin CDS过表达载体pmirGlO ［flightin］后与转染对照NC mimics相比,荧光素酶活性下降40%,达极显著水平;敲低孤雌生殖豌豆蚜4龄若蚜中miR 92a 1 p5后其表达量下调83%,其预测靶基因flightin表达量上升48%,均达极显著水平,表明flightin是miR-92a-1-p5的真实靶基因。【结论】蜕皮激素能够诱导豌豆蚜体内miRNA的表达;miR-92a-1-p5可能通过调控flightin参与孤雌蚜翅型分化;纳米载体/变性剂可以在蚜虫个体中实现miRNA的有效干涉。该研究为进一步探索蜕皮激素和miRNA互作参与孤雌蚜翅两型性分化机制奠定了基础。     

细胞生物学双语教学的探索及思考

双语教学是我国教育改革的一项全新尝试,双语教学是指在教材使用、课堂讲授、课程考试等教学环节同时使用汉语和非母语并以外语为主要教学语言的教学活动,其最终目标是学习者能同时使用母语和外语进行思维,成为既懂专业又懂外语的国际性人才;细胞生物学发展迅速,是一门前沿性、国际性课程;对细胞生物学进行双语教学,使学生在掌握专业知识的同时,提高了英语水平,能满足学生查阅英文文献、写作专业英语文章、进行英语交流的需要,我们对细胞生物学双语教学进行尝试与探索,通过选择合适教材,保证教师师资力量,运用合理的教学方法,建设素材库和网络课程等方面进行努力,取得了较好的效果,提高了教学质量,为培养高素质的人才打好基础。     

有翅和无翅豌豆蚜中翅型分化信号通路相关微小RNA及其靶基因的表达差异

【目的】前期研究发现麦长管蚜Sitobion avenae孤雌蚜有翅和无翅个体中存在很多差异表达的微小RNA(microRNA, miRNA),本研究旨在进一步明确这些miRNA在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum中发挥作用的发育阶段,探索miRNA调控孤雌蚜翅两型性分化的机制。【方法】选择在麦长管蚜有翅蚜和无翅蚜中显著差异表达,且靶基因为蜕皮激素、胰岛素信号通路及翅型发育关键基因的5个miRNA(Let-7,miR-92a, miR-92b, miR-92a-1-p5和miR-277),利用qPCR检测这些miRNA及其靶标基因在豌豆蚜3-4龄若蚜和成虫有翅和无翅个体中的表达谱;同时利用双荧光素酶活性检测法对上述miRNA的靶基因进行验证。【结果】表达谱分析发现,这5个miRNA在豌豆蚜成虫中表达量均高于其在若蚜中的表达量,而其预测的靶基因在4龄若蚜中的表达量均高于其在成虫中的表达量,表明miRNA对其靶基因的调控作用可能集中在成虫阶段。分析豌豆蚜有翅和无翅个体中5个miRNA的表达情况发现,在成虫有翅个体中5个miRNA的表达量均高于无翅个体中的,其中miR-277表达差异最显著,成虫有翅个体中的表达量是无翅个体中表达量的7.5倍;其次为Let-7,表达差异达3倍。而Let-7在3龄有翅若蚜和无翅若蚜中表达差异最显著,有翅个体中的表达量是无翅个体中的37.8倍;其次为miR-277,表达差异达7.6倍。比较5个miRNA与其靶基因在豌豆蚜3-4龄若蚜及成虫有翅和无翅个体中的表达发现,miRNA Let-7和miR-92b的表达趋势分别与其靶基因abrupt和Foxo的基本相反。荧光素酶活性检测结果显示,Let-7的真实靶标为abrupt,共转染Let-7模拟物后与对照相比,荧光素酶活性下降53%,达极显著水平。其他miRNA与靶标基因的互作不显著。【结论】首次发现miRNA对豌豆蚜孤雌蚜翅型分化相关基因的调控可能发生在成虫阶段。Let-7可能通过调控abrupt基因参与孤雌蚜翅型分化。该研究为进一步探索miRNA参与孤雌蚜翅两型性分化的机制奠定了基础。     

家蚕snoRNA Bm-15的细胞定位及与类Notch受体基因的互作关系

【目的】前期研究中发现的一个家蚕Bombyx mori C/D box snoRNA Bm-15能够与类Notch受体基因(Notch-like receptor gene,NLR)发生体外互作。本研究旨在了解家蚕中snoRNA Bm-15与NLR的互作机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测snoRNA Bm-15和NLR在家蚕幼虫、蛹及成虫不同发育阶段的表达谱;利用原位杂交鉴定snoRNA Bm-15与NLR在BmN4细胞中的定位,以探索两者之间的互作机制。【结果】表达谱分析发现,snoRNA Bm-15及NLR在家蚕幼虫期的表达趋势基本一致,均呈现先下降后上升的趋势,2龄幼虫中表达量最低。在家蚕化蛹过程中,snoRNA Bm-15表达量呈现逐渐下降的趋势,到处女蛾时表达量最低。而NLR在雌虫化蛹后第1天表达量最低,处女蛾中表达量最高。利用原位杂交进行细胞定位发现,snoRNA Bm-15不仅存在于BmN4细胞核中,在细胞质中也有分布;而NLR则大部分分布于细胞核中,与Bm-15在核内有位置重叠。【结论】首次在鳞翅目昆虫中发现一个snoRNA Bm-15同时存在于细胞核和细胞质中,与其互作的基因NLR则主要存在于细胞核中,与Bm-15有位置重叠。二者在家蚕幼虫阶段存在一致的表达模式,在化蛹及化蛾过程中存在相反的表达模式,提示snoRNA Bm-15与NLR在家蚕不同发育阶段可能存在不同的互作模式。     

利用体腔显微注射法实现非编码RNA在家蚕头部稳定过表达

【目的】通过体腔显微注射非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)过表达载体,研究注射后ncRNA在家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中的表达情况,探索研究家蚕ncRNA功能的便捷方法。【方法】利用显微注射仪(玻璃显微注射针)在家蚕5龄第3天幼虫第7-8腹节褶皱处分别注射家蚕ncRNA Bm-15和Bm-152过表达载体piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-15]和piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152],注射48 h后提取家蚕幼虫头、胸、尾部、腹部背板、腹部腹板和丝腺总RNA,荧光定量PCR检测Bm-15和Bm-152在家蚕幼虫不同组织中的表达情况。【结果】采用玻璃显微注射针造成的创伤面小,注射后家蚕出现感染和死亡的比例低于10%。注射ncRNA Bm-15过表达载体后,在家蚕幼虫头部和尾部都检测到Bm-15的显著性过表达,头部中Bm-15表达量较注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时上升了17倍,在其他4个组织中Bm-15表达量与正常饲养组家蚕对照相比变化不显著。注射Bm-152过表达载体后,同样在家蚕幼虫头部和尾部都检测到Bm-152的显著过表达,其中头部中的表达量较注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时上升了6. 6倍。腹部背板和丝腺中Bm-152过表达效果也较明显,分别是注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时表达量的3. 4和4. 5倍。【结论】体腔显微注射ncRNA过表达载体可以实现ncRNA在家蚕头部中稳定过表达。本研究为后续研究神经相关ncRNA的功能提供了较好的思路和方法。