中国大鲵幼体的性别分子鉴定与性腺形态

为探明中国大鲵(Andrias davidianus)雌雄幼体的性腺发育特征,确定适合的性别分子鉴定方法,对15尾5月龄和17尾17月龄养殖个体进行形态测量、解剖观察、性腺组织切片及PCR扩增雌性特异DNA片段。结果发现,引物adf225和adf340的扩增效果好,判定5月龄个体8雌7雄;17月龄个体8雌9雄,与依据性腺形态结构区分的结果一致。体视显微镜下5月龄幼体中肾腹侧有两条半透明细条状的原始生殖嵴;组织切片显示生殖细胞形态分化不明显。17月龄卵巢波浪状弯曲,有颗粒感,精巢呈光滑的白条状,形态分化明显;组织切片显示,卵巢分化出体积较大的卵母细胞,同时保留原始卵泡,精巢分化出生精小叶和精原细胞、支持细胞。外形测量显示,5月龄与17月龄性二型不明显,不能根据外形判断性别。本研究确定了大鲵幼体性别分子鉴定的最佳引物,可用于养殖过程中雌雄选配,以节约资源。     

奥利亚罗非鱼DMRT1和DMRT4抗体制备及组织表达谱分析

DMRT1和DMRT4是DMRT基因家族的成员,该家族成员与果蝇的性别决定基因和线虫性别决定基因一样,所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的保守基序,即DM结构域,并以锌指结构与特异DNA序列相结合,在性别决定和分化发育中起调控作用。采用RT-PCR方法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢中扩增克隆出DMRT1和DMRT4全长cDNA片段,构建表达载体,在大肠杆菌中表达了BMP-DMRT4和BMP-DMRT1蛋白。经Xa切割、Amylose-sepharose柱层析纯化后作为抗原免疫新西兰白兔制备了DMRT1和DMRT4多克隆抗体,并进行纯化。对纯化多抗进行Western blot分析,结果表明获得了高特异性的DMRT1和DMRT4抗体。为了观察DMRT1和DMRT4在组织中的表达谱,首先,我们通过实时荧光定量RT-PCR检测雌雄奥利亚罗非鱼多种组织mRNA的表达,仅在卵巢和脑中检测到DMRT4,在精巢中检测到DMRT1;其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blot分析,仅分别在卵巢和精巢中检测到DMRT4和DMRT1蛋白的表达;制备多种奥利亚罗非鱼组织切片,使用纯化的DMRT4和DMRT1多抗进行免疫组织化学分析,发现DMRT4仅在卵巢表达,而DMRT1仅在精巢表达。这些结果有助于阐明DMRT4和DMRT1的功能及在鱼类性别调控中的作用。     

中国大鲵生殖激素的初步研究

首次全面报道了中国大鲵6项生殖激素的研究结果.采用电化学发光技术,检测了雌雄中国大鲵在繁殖期与非繁殖期的血清中垂体泌乳素、卵泡生成激素、黄体生成激素、雌二醇、孕酮和睾酮6项生殖激素的含量.实验结果表明,雌雄性中国大鲵在繁殖期间与非繁殖期间的6项生殖激素检测结果没有明显的差异,对中国大鲵血清中的生殖激素与繁殖期的相关性进行了初步探讨,为中国大鲵生殖内分泌学的研究和人工繁殖积累了资料.     

养殖施氏鲟的性腺转录组特征分析

鲟是目前世界上最古老的软骨硬鳞鱼类之一, 雌雄个体之间无明显的第二性征。为了解人工养殖下鲟性腺发育的分子特征, 研究以人工养殖2龄施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)为研究对象, 对其精巢与卵巢进行转录组测序分析。结果发现, 雌雄性腺中共有19690个差异表达基因转录本, 其中与性别分化相关基因包括转录因子Dmrt1、Sox9、Foxl2等和生长转化因子Amh、Bmp15、Gdf9等。另外, 通过差异表达基因KEGG代谢通路富集分析发现了4条与卵巢发育相关的通路, 分别为黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、卵巢类固醇合成、促性腺激素释放激素信号通路。其中, 卵巢类固醇合成通路中18个差异表达基因的表达模式暗示了2龄施氏鲟限制卵巢雌激素的合成, 但精巢中雄激素的合成未受影响。研究结果为研究鲟性腺分化和发育机制以及今后在mRNA表达水平上鉴定鲟性别提供了基础。     

中国大鲵Sox2基因全长cDNA序列的克隆及组织表达分析

Sox2是Sox转录因子超家族B1亚族成员之一,对胚胎发育和神经细胞的维持有重要作用。本研究以中国大鲵(Andrias davidianus)性腺组织为材料,通过RT-PCR和RACE方法成功克隆到中国大鲵Sox2基因全长2 233 bp c DNA。系统进化树分析表明,中国大鲵与红腹蝾螈、火焰蝾螈及六角恐龙聚成一支,这与其在两栖类中分化较早相一致。实时荧光定量PCR检测Sox2基因在中国大鲵组织表达结果显示,其在性腺中的表达量最高,肾脏中次之,在肠道中几乎不表达,表明Sox2基因可能在大鲵性腺发育和生长发育过程中发挥了重要作用。这为今后进一步研究Sox2基因在大鲵性别分化中的功能提供了参考。     

中国大鲵生殖腺胚后发育的形态学观察

为探寻中国大鲵(Andrias davidianus)生殖腺胚后发育的特点及规律,采用解剖学与组织学技术对其形态结构变化进行了观察.结果表明,大鲵的原始生殖腺开始出现于出膜28～49 d;出膜133～175 d时一些个体生殖腺内已初步分化出原始卵泡;出膜259 ～343 d时一些个体生殖腺内已初步分化出生精小叶;出膜427 d时,卵巢已明显分化为皮质与髓质,且髓质内出现了卵巢腔,精巢内生精小叶及其内的腔隙、精巢间质等分化已较为明显;出膜511 d时精巢分化为明显的生精小叶和非成熟小叶两个区域.本文认为,大鲵与其他无羊膜类原始生殖腺的分化一般发生在胚后阶段,而且雌性的分化时间早于雄性.     

青鳉(Oryzias latipes)smad3的克隆与表达分析

鱼类性染色体的原始性导致性别决定基因的多样性.高等动物中的单个基因,在鱼类中因为基因组复制而产生多个同源基因,呈遗传多样性.TGF-β家族在硬骨鱼性别决定和性别分化的过程中发挥关键作用.smad3是性腺体细胞衍生因子(gsdf)的下游基因,可将TGF-β信号从细胞表面传递至细胞核.本研究从青鳉精巢和卵巢组织cDNA中克隆了smad3a、smad3b基因的CDS全长序列.蛋白序列的同源性比对和系统发生分析显示,smad3在高等脊椎动物中只有一种,而在鱼类却有两种.RT和定量PCR分析结果显示,smad3在多组织中普遍表达,在精巢中表达高于卵巢.青鳉smad3a和smad3b的表达同性腺分化紧密关联,提示其在性腺雌雄性分化和发育中可能具有重要作用.     

蓝太阳鱼第一次性周期性腺发育的组织学

蓝太阳鱼(Lepomis cyanellus)是广东省于1997年从北美引进的小型淡水鱼类,本文采用组织切片技术对蓝太阳鱼的性腺发育进行了研究。蓝太阳鱼的性腺发育程序可以分为5个时期。在1月龄,卵巢和精巢处于第Ⅰ期;2~3月龄时,卵巢和精巢发育到第Ⅱ期;4月龄时发育到第Ⅲ期;5~6月龄时发育到第Ⅳ期;7~8月龄时达到性成熟第Ⅴ期。过冬时,卵巢退化到第Ⅱ~Ⅲ期,而精巢仍停留在第Ⅴ期。成熟卵巢的成熟系数为2.80%~8.10%,成熟精巢的成熟系数为1.45%~3.45%。精巢和卵巢发育都为不完全同步型,且精巢发育比卵巢稍快。蓝太阳鱼的繁殖期在广州地区为3~11月,为多次产卵类型。本文从生殖和生长的关系上对蓝太阳鱼生长缓慢的原因进行了初步探讨,并将蓝太阳鱼作为一种鱼类实验动物的可行性进行了分析。     

超声成像在扬子鳄卵巢等器官形态检测中的应用

扬子鳄(Alligator sinensis)是中国特有的珍稀物种,该物种的生长、繁殖状况一直备受关注,分别在2014年3月(冬眠期)和6月(繁殖期)对17条成年雌性扬子鳄腹部应用VIVIDⅠ型彩色多普勒超声(B型超声)便携诊断仪进行检测,并对3月份卵巢卵泡大小用SPSS 19.0回归分析。扬子鳄心、肝、肠等内脏器官形态在B型超声诊断仪下清晰可见。冬眠期17条扬子鳄两侧卵巢中共检测到41枚卵泡,繁殖期共42枚。冬眠期卵泡处于低回声暗区或无回声暗区的未成熟状态,繁殖期多数卵泡的发育状态与3月相同,少数卵泡呈高回声暗区,此时已形成卵黄颗粒,也有呈高回声亮光区形成卵黄膜的卵泡。对3月份检测的17条扬子鳄具有卵泡的19个卵巢大小与卵泡大小进行回归分析,卵巢随卵泡发育而增大。本研究探讨了B超这种低损伤方法对扬子鳄检测的有效性,同时评估卵泡发育状况,提高繁殖鳄的筛选正确率。     

日本科学家发现基因开关可决定生殖细胞性别

动物的生殖细胞与体细胞不同，有雌雄之别，可分为精子和卵子2种。由于生殖细胞是在移动到卵巢和精巢后才分化为卵子和精子，这种性别差异产生的过程令人很感兴趣。日本自然科学研究机构基础生物学研究所小林悟研究小组在《科学》杂志网络版上发表论文说，他们通过对果蝇的研究发现，一个名为SxL的基因是决定生殖细胞性别的“开关”。     

Genetic diversity of Chinese giant salamander (Andrias davidianus) based on the novel microsatellite markers

Chinese giant salamander (Andrias davidianus) is a rare amphibian species in the world. Microsatellite markers are a promising tool for accurate estimation population structure and genetic diversity. In this paper, we isolated novel microsatellite marker for Chinese giant salamander using fast isolation by AFLP of sequences containing repeats (FIASCO) method. More than 50% sequences in 132 clones had repeat number over ten times with di or trinucleeotide repeat except of (GA)₁₂. Seventy pairs of primers were designed and eleven polymorphic microsatellite loci were characterized for wild and cultivated Chinese giant salamander populations. The allele number was from 3 to 9 in different loci. Polymorphism information content was from 0.544 to 0.702 in cultivated population. The results implied more alleles and PIC were in the wild population than cultivated population. The observed heterozygosities in two populations were higher than 0.553. The data analysis suggested that the cultivated population has lower genetic diversity than wild population, which it??s perhaps owing to inbreeding in artificial breeding. To our knowledge, it??s the first time to isolated microsatellite markers for Chinese giant salamander. The result indicated that the markers were suitable for the population genetic analysis of Chinese giant salamander.     

患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

【目的】确定导致大鲵(Andrias davidianus)细菌性感染死亡的病原。【方法】从大鲵肝脏中分离细菌,通过Biolog微生物自动鉴定系统及分子生物学方法对纯培养的细菌进行鉴定,再用大鲵和鲫鱼分别进行人工感染试验,以确定分离菌的致病性,同时对分离到的病原菌进行药物敏感试验。【结果】从患病大鲵肝脏中分离到一株致病菌JZ01,经人工感染健康大鲵,可复制与自然发病相同的症状,且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的病原菌。该致病菌对健康鲫鱼也有致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。药物敏感性试验表明,该菌株对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟等9种药物高度敏感。【结论】弗氏柠檬酸杆菌是大鲵的一种致病菌。本文在国内外首次报道了该菌对大鲵具有致病性。     

中国大鲵肝脏的超微结构

应用透射电镜对中国大鲵的肝脏进行了超微结构研究.观察表明,大鲵肝不具肝小叶,与其他脊椎动物有所不同.肝细胞含有单个卵圆形的核;细胞质内含有粗面内质网、高尔基囊泡、线粒体、糖原颗粒和脂滴等细胞器和内含物.胆小管由两个相邻肝细胞质膜凹陷围成,而肝血窦则由内皮细胞的胞质构成.胆小管腔和窦周隙内浸润许多由肝细胞发出的微绒毛结构.还发现了枯否氏细胞和贮脂细胞.还讨论了中国大鲵肝脏的一般形态结构特点.     

Gonadal structure of the serial-sex changing gobiid fish Trimma okinawae

In order to obtain basic information about the role played by endogenous sex hormones in bringing about sex changes in the serial-sex changing gobiid fish Trimma okinawae, the gonadal structure of male and female phases were observed histologically. Steroid-producing cells (SPC; Leydig cells in a testis) were observed ultrastructurally in the ovaries and testes of both female-phase and male-phase fish. In addition, gonadal expression of P450 cholesterol side-chain-cleavage (scc) was examined immunohistochemically. Gonads of fish in female and male phases were observed to have both ovaries and testes simultaneously. Female-phase fish had matured with many developed vitellogenic oocytes, while male-phase individuals had immature ovaries with many numbers of previtellogenic oocytes at the perinucleolus stage. Testes of fish in different sexual phases had active spermatogenic germ cells. Organellae of SPC in the ovaries of female-phase fish had active structures of steroid production. In contrast, SPC in the ovaries of male-phase fish did not show active structures of steroid production. Immunopositive reactions against the scc antibody in the ovaries of female-phase fish were very strong, but immunoreactions in the ovaries of male-phase fish were very weak. In the testis, moderate immunopositive signals were obtained from dual-phase male/females.     

大鲵保护生物学及其研究进展

大鲵（Andrias davidianus)为我国特有的珍稀两栖动物,已列入国家二级保护动物名录,并列入CITES公约附录Ⅰ中。自20世纪50年代起,由于过度收购、非法捕杀和栖息地丧失等原因,大鲵种群数量下降极为严重,湖南、安徽等地的大鲵产量在20世纪50年代至70年代下降超过80％,分布区也极度萎缩,形成了12块岛屿状区域,目前分布于以我国中部山区的长江流域为主的17个省区。部分已建立的大鲵保护区经费短缺,人员不足,管理不力,状况不容乐观。非法捕捉和栖息地丧失仍是威胁大鲵生存的主要因素,保护管理力度还需进一步加强。     

中国大鲵研究概况

中国大鲵(Andrias davidianus)为我国特有物种, 也是国家二类保护水生野生动物。野生大鲵多栖息在山区溪流里, 喜穴居, 怕光怕声, 以鱼蟹等水生动物为食, 从数量上看, 以陕西秦岭山区居多。大鲵经济价值极高, 在美食、保健、医药、观赏等方面均具有广泛开发利用的前景, 因而颇受社会各界关注。近年来对大鲵的科学研究涉及多个方面, 包括疾病方面, 如病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫性疾病等; 生理与发育方面, 如生长、发育、应激反应等; 遗传与进化方面; 保护与开发方面, 如开发药品、食品、保健品等。综上, 围绕大鲵从不同角度所展开的研究非常丰富。大鲵基因水平的研究仍是未来研究的热点和趋势, 其成果将为日后更深层的探究奠定基础。     

Major biological activities of the skin secretion of the Chinese giant salamander, Andrias davidianus

Amphibian skin can produce abundant secretion which contains many bioactive compounds. In this work, skin secretion of the Chinese giant salamander (Andrias davidianus) was obtained by mild electrical stimulation of the dorsal skin surface, and the main physiopathological properties of the secretion were described. Intraperitoneal administration of the skin secretion caused lethal effects in mice. Low doses of the skin secretion induced significant systemic and local effects like edema and nociception in mice. The activities of phospholipase A2 and proteolytic enzyme were likely related to the physiopathological activities observed. The work proved the complex toxic effects of the Chinese giant salamander skin secretion and provided clues to study its physiological function further.     

史氏鲟的生态习性及其保护性利用

史氏鲟是中国现存鲟鱼中最具经济价值的优质珍稀鱼类,集观赏、美食于一体,具有个体大、寿命长、幼鱼成活率高、生长速度快等特点,经驯化后能迅速生长,对环境有较强的适应性;通过对史氏鲟生态习性、饲料和加工的研究,探讨史氏鲟繁养及利用技术;在对史氏鲟进行保护性利用的前提下深入研究史氏鲟的养殖和加工,为其他鲟鱼的研发积累经验。     

Resource-dependent sex-allocation in a simultaneous hermaphrodite

Most sex allocation theory is based on the relationship between the resource investment into male and female reproduction and the consequent fitness returns (often called fitness-gain curves). Here we investigate the effects of resource availability on the sex allocation of a simultaneously hermaphroditic animal, the free-living flatworm Macrostomum lignano. We kept the worms under different resource levels and determined the size of their testes and ovaries over a period of time. At higher resource levels, worms allocated relatively more into the female function, suggesting a saturating male fitness-gain curve for this species. A large part of the observed effect was due to a correlated increase in body size, showing size-dependent sex allocation in M. lignano. However, a significant part of the overall effect was independent of body size, and therefore likely due to the differences in resource availability. Moreover, in accordance with a saturating male fitness-gain curve, the worms developed the male gonads first. As the group size was kept constant, our results contrast with expectations from sex allocation models that deal with local mate competition alone, and with previous experiments that test these models.     

大鲵栖息地环境的初步研究

2001年4月至8月,对湖南省壶瓶山自然保护区河流中大鲵(Andrias davidianus)的栖息洞穴,首次使用量化指标进行分析。通过主成分分析发现,大鲵栖息洞穴处的水深、洞口宽、水流速度和河底的组成是影响大鲵选择洞穴的主要因子,而海拔高度和洞口高的影响不大。同时,对重庆市酉阳县、陕西省太白县、河南省卢氏县大鲵自然保护区和新安县青要山大鲵自然保护区大鲵的栖息河流特征进行了调查。结果表明大鲵的栖息河流类型可分为溪流、U型河流、平底型河流和暗河4类,而且大鲵对其栖息洞穴的质量要求较高。