草菇Vvrin1基因RNAi转化子的筛选及其转录组分析

草菇味道鲜美,食用价值高,是我国主要栽培的商业食用菌之一。MADS-box转录因子对真核生物的生长发育和信号传导具有关键性的调控作用。本研究通过农杆菌介导的方法获得5个草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因的RNA干扰转化子,并进一步对转化子的表型进行分析,发现5个转化子菌丝在PDA固体培养基和栽培料中的生长速度均显著小于（P<0.05）转化野生型菌株H1521,且转化子菌丝颜色呈黄白色,较粗,较稀疏。出菇实验发现,RNA干扰转化子生长停滞在菌丝阶段未能形成原基出菇。转化子菌丝阶段的转录组测序数据发现,上调基因主要富集在核糖体、氨基酸生物合成和次生代谢物的生物合成等途径;下调基因主要富集在MAPK信号通路、脂肪酸氧化、磷脂酰肌醇信号系统等途径。进一步推测MADS-box转录因子Vvrin1基因表达水平降低会影响MAPK信号通路和磷脂酰肌醇信号通路的表达,进而降低菌丝生长速度,影响原基形成。     

MADS-box转录因子编码基因Vvrin1在草菇不同发育时期的表达分析

草菇是我国土特产出口的主要种类之一,而采后易开伞问题限制了草菇的贮藏及运输。MADS-box转录因子对植物的成熟衰老和真菌的子实体发育起到重要的调控作用。目前尚未见草菇MADS-box转录因子的相关报道。本研究通过生物信息方法及分子生物学的手段对草菇的基因组、转录组数据进行分析,获得了草菇MADS-box转录因子基因Vvrin1。该基因全长1 392bp,含2个内含子,编码419个氨基酸残基。该转录因子含有一个MADS-box结构域,序列与双孢蘑菇Agaricus bisporus、斑玉蕈Hypsizygus marmoreus和灰盖鬼伞Coprinopsis cinerea的MADS-box转录因子相似性分别为71%、67%和61%。通过表达谱数据及荧光定量PCR分析表明Vvrin1基因在草菇子实体伸长期菌柄的表达量出现高峰,具有极显著性差异（P<0.01）,推测该转录因子参与调控草菇菌柄的伸长,菌盖的开伞。这些结果为草菇成熟衰老（特别是开伞）的调控研究提供数据支持。     

农杆菌介导的小孢拟盘多毛孢遗传转化及突变体筛选

本研究通过农杆菌EHA105介导的方法,以含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp为转化载体,对小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora KFRD-2菌株进行遗传转化。基于潮霉素及GFP荧光抗性进行转化子的初步筛选,随后,进一步对转化子的菌落特征、菌丝生长速率、产孢量、荧光稳定性及致病力进行验证。结果获得阳性转化子100余株,转化效率达200个转化子/10⁶个孢子。大部分转化子与野生型菌株无明显形态及致病力差异。同时,获得了14株菌丝形态、产孢量或致病力与野生型存在明显差异的突变株,可用于小孢拟盘多毛孢关键致病基因的挖掘验证及致病机理等研究。     

香菇HMG-box转录因子lelcrp1基因的功能

【目的】研究香菇(Lentinula edodes) HMG-box转录因子LELCRP1 (Lentinula edodes lignocellulase genes regulation protein 1)在木质纤维素降解相关酶基因表达中的功能与作用。【方法】通过double-joint及同源重组方法构建lelcrp1基因RNAi载体,采用根癌农杆菌介导转化的方法转入香菇异核菌株W1菌丝中,筛选得到RNAi转化子,通过Southern杂交检测插入片段在菌株W1基因组中的拷贝数量。采用荧光定量PCR检测RNAi转化子木质纤维素降解酶基因表达水平变化,并在含有3.5μg/mL潮霉素的MYG平板上测定RNAi转化子的菌丝生长速度。【结果】获得了4个lelcrp1基因表达水平与出发菌株W1相比显著下调6–7倍的RNAi转化子。Southern杂交结果显示,lelcrp1基因RNAi片段已成功整合至香菇菌株W1基因组内,并以单拷贝形式存在。对其中2个RNAi转化子的26个木质纤维素降解酶基因表达水平进行分析,发现其中9个纤维素酶基因、1个半纤维素酶基因、2个辅助酶AA9基因和1个锰过氧化物酶基因的表达水平均表现出明显的下调。平板生长试验表明,RNAi转化子菌丝生长速度均显著慢于出发菌株W1。【结论】通过RNAi技术成功抑制了香菇异核菌株中lelcrp1基因表达水平,并导致部分纤维素及木质素酶基因表达水平相应下调,首次发现HMG-box结构域的转录因子能调控木质纤维素降解相关酶基因表达。     

RNAi法分析广东虫草热激蛋白40 CgDnaJ05基因功能

DnaJ蛋白(热激蛋白40)在机体生长发育和适应逆境环境过程中起着重要作用。以广东虫草GDGM30035为材料,克隆获得CgDnaJ05基因,CDS为2 361 bp,编码786个氨基酸,生物信息学分析结果表明CgDnaJ05蛋白含有DnaJ蛋白结构域,属于碱性、不稳定和亲水性蛋白质。以CgDnaJ05蛋白DnaJ保守结构域240 bp的反向互补片段为干扰片段,构建CgDnaJ05基因的双向启动子沉默载体;通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化法侵染广东虫草菌丝,筛选获得9个相对稳定的CgDnaJ05沉默转化子。qRT-PCR分析表明,转化子CgDnaJ05相对表达量下调至野生型菌株的20%-82%;与野生菌丝相比,转化子菌丝生长速度显著下降,且CgDnaJ05下调越明显,菌丝减缓速度越显著,同时,转化子原基的形成受到显著抑制。研究表明：广东虫草CgDnaJ05基因明显影响广东虫草菌丝生长和原基形成,对广东虫草生长发育具有重要的调控作用。     

菰黑粉菌T-DNA突变体库的构建及分析

通过建立适用于菰黑粉菌Ustilago esculenta的农杆菌介导遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)体系,构建菰黑粉菌T-DNA插入突变体库。针对性地筛选双核菌丝形成缺陷型转化子,并对T-DNA插入位点进行分析,为研究菰黑粉菌二态型转换的分子调控机理打下基础。以构建的菰黑粉菌自融合菌株TSP为出发菌株,以含有遗传霉素(G418)抗性基因(neo)的质粒为载体,通过ATMT构建菰黑粉菌T-DNA突变体库,并对诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度、转化的共培养时间、农杆菌浓度和菰黑粉菌芽孢子浓度等建库影响因素进行单因素条件试验,筛选最优条件;对继代培养的转化子基因组中的遗传霉素抗性基因进行PCR检测,验证转化子遗传稳定性;对突变体库中的转化子双核菌丝生长情况进行观察,测定其双核菌丝形成能力;对上述双核菌丝形成缺陷型转化子进行基因组重测序,分析其T-DNA插入位点。当遗传霉素浓度为75 μg/mL时,菰黑粉菌的生长被完全抑制。当AS浓度为100 μg/mL、共培养时间为24 h、孢子浓度为1×10⁵个/mL、农杆菌浓度为OD₆₀₀=0.3时,转化获得转化子的效率最高,为菰黑粉菌ATMT最优转化体系。在突变体库中随机选取7株转化子在YEPS固体平板上继代培养10代,仍然能够通过PCR的方法在基因组中检测到neo基因片段,说明T-DNA成功插入TSP菌株基因组且稳定遗传。针对部分转化子进行双核菌丝生长能力测定,有5株转化子的菌落边缘没有形成菌丝,而TSP菌株的边缘长出了明显的菌丝,说明这5株转化子双核菌丝形成的能力丧失。对上述双核菌丝形成缺陷型转化子中的其中2个(TSP-1、TSP-23)进行基因组重测序,比对结果显示,TSP-1插入位点位于其交配型基因a位点的(GenBank: MK097140.1) mfa2.1基因的外显子区域,TSP-23插入位点位于两个假定蛋白之间。本研究优化了菰黑粉菌ATMT遗传转化体系,构建了菰黑粉菌T-DNA插入突变体库;筛选到双核菌丝生长缺陷型突变体,并通过基因组重测序的手段明确了相关突变体的T-DNA插入位点,为后续菰黑粉菌二型态转换的调控机理研究奠定了一定的基础。     

梯棱羊肚菌镉胁迫响应基因ATX1功能分析

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种可以大田覆土栽培的珍稀食用菌,而土壤重金属污染状况日益严重,对梯棱羊肚菌菌丝生长和子实体产品质量安全构成了潜在的威胁。本研究先采用镉离子胁迫处理梯棱羊肚菌菌丝体,RT-PCR检测发现候选基因ATX1的表达量显著下调。克隆梯棱羊肚菌ATX1基因,对ATX1p蛋白结构进行功能预测,发现ATX1p可能与铜离子转运及重金属胁迫相关。然后分别构建ATX1的超表达和RNAi基因沉默载体,采用农杆菌介导的转化方法,将其转入梯棱羊肚菌同核体菌株A50中,分别筛选到4个ATX1表达显著上调的超表达转化子和4个ATX1表达显著下调的RNAi基因沉默转化子,镉敏感性检测发现ATX1的RNAi基因沉默转化子表现为镉抗性增强,而ATX1超表达转化子则表现为镉抗性减弱。结果表明,梯棱羊肚菌ATX1基因表达与镉抗性呈负相关,ATX1p可能在梯棱羊肚菌镉胁迫响应过程中发挥着某种重要作用。     

生理生化指标与草菇开伞时间的相关性分析

通过对保藏在福建农林大学菌物研究中心的36株不同来源的草菇菌株菌丝阶段8个生理生化指标检测并做出菇实验,探究草菇性状的多样性及各因素与草菇子实体开伞时间的相关性。结果表明:供试菌株中各性状的变异系数都比较少,品种资源均一化程度较高;二次多项式逐步分析获得了一个拟合程度较好的草菇开伞情况预测模型,根据方程得出果胶酶、漆酶、羧甲基纤维素酶(CMC酶)、菌丝浓密度、耐酸能力以及它们的互作对草菇开伞有密切关系,作用力从大到小为果胶酶耐酸能力与果胶酶互作CMC酶漆酶与果胶酶互作耐酸能力菌丝浓密度与CMC酶的互作菌丝浓密度与漆酶互作耐酸能力与漆酶互作漆酶,而菌丝生长速度、多酚氧化酶、木聚糖酶对草菇开伞难易影响不大。     

过表达漆酶基因Lelcc1的香菇菌株构建及表型分析

真菌漆酶（laccase）是一种多酚氧化酶,在真菌生长发育中具有重要作用。本研究采用根癌农杆菌介导转化的方法,以香菇Lentinula edodes菌株W1为受体菌株,在Leactin基因启动子调控下过表达Lelcc1基因;对其中7个单拷贝插入的转化子进行qRT-PCR分析,7个Lelcc1基因表达量较出发菌株W1均上调了1.5-8倍。进一步分析了这7个转化子的遗传稳定性;挑取了3个稳定的转化子进行表型分析,主要包括不同培养基中的生长速度、代料栽培过程中菌棒转色程度、以及透射电镜观察菌丝细胞的超微结构。发现转化子和受体菌株W1的生长速度无显著差异,但代料栽培过程中转化子较W1转色更快,菌棒表面颜色更深;透射电镜观察菌丝细胞的超微结构发现在细胞壁厚度、细胞膜形态等方面,其中两个超量表达转化子与W1间存在显著差异。结果表明,香菇Lelcc1基因可能参与了转色过程中色素合成或积累,也可能与细胞壁形成有关。     

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生

目的: 通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性。方法: 基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(ΔFolprp4)。构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验。结果: 与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状。敲除突变体的另一个显著变化是ΔFolprp4的分生孢子产量显著下降。侵染实验表明,ΔFolprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低。互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株。结论: Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关。     

泛素化结合酶E2抑制剂对草菇15 ℃保鲜的影响

为了改进草菇低温保鲜方法,在15 ℃贮藏条件下,采用泛素化结合酶E2 (UBEV2)抑制剂对草菇子实体进行处理,并开展相关生理指标和基因表达检测。结果表明,使用100 μmol/L的UBEV2抑制剂L345-0044维持了草菇较好的品质,提高了草菇可溶性糖的含量。低温明显提升抑制剂处理下的碱性蛋白酶和中性蛋白酶活力,并证实了低温胁迫显著提高了抑制剂处理下的一种类型蛋白酶肽基赖氨酸金属内肽酶的表达。本研究证实了草菇可溶性糖和高活性的冷诱导金属内肽酶对于延长草菇的低温保鲜时间是必须的。     

改变培养基碳源复壮草菇退化菌种

碳源是草菇重要的营养源之一,草菇菌种在添加葡萄糖的传统PDA上长期继代会导致菌种退化。本研究用蔗糖、果糖、甘露醇、海藻糖代替PDA中的葡萄糖,对草菇原种（D0）和退化菌株（D1-D3）进行复壮。结果表明：改变碳源对D0影响不显著。蔗糖、果糖、甘露醇、海藻糖均可提高D1-D3的气生菌丝密度、菌丝生长速度和生物量,诱导厚垣孢子产生,并增加菌丝多糖和蛋白质含量;有效抑制了活性氧O₂ ^-·、H₂O₂的积累;提升了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性,但过氧化氢酶（CAT）活性变化不显著;且菌种退化程度越高,复壮效果越好,海藻糖的效果最佳。与对照组相比,海藻糖处理组使退化最严重的D3的菌丝生长速度和生物量分别提高了75.00%和66.67%,多糖和蛋白质含量分别增加了22.49%和16.58%;O₂ ^-·和H₂O₂分别降低了12.50%、12.83%;POD和SOD分别提高了33.33%和255.56%。本研究通过改变培养基的碳源,有效复壮了草菇退化菌种的菌丝特性;也为延缓食用菌菌种退化研究提供参考。     

草菇子实体多肽提取工艺及其抗氧化活性

为了优化草菇子实体多肽的提取工艺和探究其抗氧化活性,以草菇子实体为原料,采用酶解法提取草菇子实体多肽,通过单因素试验得出最佳的酶解工艺,并使用Box-Behnken设计试验组合。结果表明：草菇子实体提取多肽的最佳工艺为料液比1:52 (g/mL)、加酶量7 200 U/g、酶解温度43 ℃,此工艺条件下的多肽得率为67.76%。从1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、铁离子还原能力、超氧阴离子自由基清除能力和羟自由基清除能力4个方面研究其体外抗氧化能力,结果表明,草菇子实体多肽对DPPH自由基清除率为74.11%,超氧阴离子自由基和羟自由基清除率分别在69.64%和91.83%达到稳定,草菇子实体多肽还具有一定的还原力,说明草菇子实体多肽可以作为优质抗氧化肽的良好来源。该研究为草菇多肽的高效制备和抗氧化肽等高附加值产品的研发提供理论依据。     

草菇不同菌株RT-qPCR参考基因筛选

适合的参考基因是应用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术进行基因表达分析的前提。本研究以7个食用菌常用参考基因(β-TUB 1、GPD、ACTB、Ras、α-TUB、β-TUB 2和SPRYp)为候选基因,利用RT-qPCR检测其在草菇常用生产菌株(CPS)V844、V5、V971和V844继代退化菌株(SDS) T8、T12、T16、T20中的表达;用Genorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件分析候选基因的表达稳定性,并结合几何平均数法筛选出最佳参考基因。结果表明,SPRYp、α-TUB和β-TUB 2基因适用于草菇常用生产菌株检测,SPRYp、GPD和α-TUB基因适用于草菇继代退化检测,SPRYp基因适用于两种条件的检测。两两差异分析表明,草菇常用生产菌株的最佳参考基因组合为SPRYp、α-TUB和β-TUB 2,继代退化菌株的最佳参考基因组合为SPRYp和GPD,两种条件混合菌株的最佳参考基因组合为SPRYp和α-TUB。     

聚赖氨酸联合1-MCP处理对草菇保鲜效果的影响

草菇营养丰富,但不耐贮藏,现有保鲜方法无法有效延长其贮藏期,因此延长草菇保鲜期是草菇产业化工厂生产亟待解决的关键技术。本研究以V23草菇为材料,分别用1-甲基环丙烯（1-MCP）、聚赖氨酸（ε-PL）、ε-PL联合1-MCP处理草菇,比较不同处理方法对贮藏期草菇感官、理化品质的影响,筛选出草菇贮藏的最优方法。结果表明：与其他处理组相比,ε-PL联合1-MCP处理能显著减少草菇的水分散失、保持菇体质构及表面色泽（P<0.05）;最佳组合处理浓度为0.3g/kg ε-PL和0.75µL/L 1-MCP,该处理下草菇能够保持良好的感官品质,维持较高水平的CAT、SOD活性,减少失水和MDA积累,抑制PPO活性,与其他不同处理组相比有显著性差异（P<0.05）。研究表明,0.3g/kg ε-PL联合0.75µL/L 1-MCP处理可以显著延长草菇货架期,为食用菌保鲜提供一个新思路。     

金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达

金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因（exg2）可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因（分别命名为：Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3）,并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示：Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。     

VdToxD1和VdToxD3调控大丽轮枝菌微菌核的萌发

大丽轮枝菌Verticillium dahliae是一种土传性植物病原真菌,可侵染660多种植物,引发黄萎病。微菌核是大丽轮枝菌在侵染后期形成的特殊休眠结构,可在土壤中存活14年,是黄萎病的主要初侵染来源。本研究在前期大丽轮枝菌萌发与休眠微菌核转录组分析的基础上,选择微菌核休眠状态高表达的VdToxD1和VdToxD3基因进行功能研究。结果发现,VdToxD1和VdToxD3敲除突变体菌株的微菌核萌发率分别为87.3%和86.0%,显著高于野生型菌株的64.0%;负调控微菌核萌发的转录因子VdCrz1与VdToxD1上游的-937 bp到-349 bp中的特定基序结合,与VdToxD3上游的-752 bp到-496 bp中的特定基序结合,结合位点均位于2个基因的启动子区。     

双孢蘑菇萎锈灵抗性基因定点突变的载体构建与遗传转化

为建立更为安全、有效的双孢蘑菇遗传转化体系,构建了双孢蘑菇琥珀酸脱氢酶的铁硫蛋白亚基Agsdi1突变（His突变为Leu）表达载体pAgsdi1,并通过农杆菌介导方法转化双孢蘑菇W192,经萎锈灵筛选以及PCR扩增和MnlⅠ酶切验证后获得了转化菌株。验证结果表明,点突变的铁硫蛋白亚基Agsdi1可以作为双孢蘑菇有效的抗性标记基因。因其并未引入新的外源基因,是一种比潮霉素抗性基因更为安全的筛选标记,将可用于双孢蘑菇等食用菌的遗传转化。