草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因过表达转化子菌株的构建及其生长速度的初步差异分析

新鲜草菇味道鲜美,香味浓郁,而且营养丰富,是具有中国特色的食药用菌。草菇采后极易开伞,低温贮藏（10℃以下）则容易自溶、渗水腐、发出异味,是最不易贮藏的食用菌之一。本课题组先前的研究表明草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因可能在草菇菌柄的伸长、菌盖的开伞过程中起到一定的作用。因此,本研究以Vvrin1基因为研究对象,构建该基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法进行转化草菇异核菌株H1521菌丝块。通过潮霉素抗性平板筛选,PCR扩增潮霉素抗性基因及Vvrin1基因过表达特异片段,qRT-PCR分析拟转化子菌株内的Vvrin1基因表达量,最终获得了8个比较可靠的转化子。进一步对这些转化子的表型进行初探,发现其中7个转化子的生长速度比出发菌株H1521快,具有显著性差异（P<0.05）,且转化子菌丝更浓密,菌落表面颜色更深,推测草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因可能参与了菌丝阶段生长速度和色素合成或积累的调控。研究结果为进一步研究草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因的功能提供了菌株材料及数据支持。     

MADS-box转录因子编码基因Vvrin1在草菇不同发育时期的表达分析

草菇是我国土特产出口的主要种类之一,而采后易开伞问题限制了草菇的贮藏及运输。MADS-box转录因子对植物的成熟衰老和真菌的子实体发育起到重要的调控作用。目前尚未见草菇MADS-box转录因子的相关报道。本研究通过生物信息方法及分子生物学的手段对草菇的基因组、转录组数据进行分析,获得了草菇MADS-box转录因子基因Vvrin1。该基因全长1 392bp,含2个内含子,编码419个氨基酸残基。该转录因子含有一个MADS-box结构域,序列与双孢蘑菇Agaricus bisporus、斑玉蕈Hypsizygus marmoreus和灰盖鬼伞Coprinopsis cinerea的MADS-box转录因子相似性分别为71%、67%和61%。通过表达谱数据及荧光定量PCR分析表明Vvrin1基因在草菇子实体伸长期菌柄的表达量出现高峰,具有极显著性差异（P<0.01）,推测该转录因子参与调控草菇菌柄的伸长,菌盖的开伞。这些结果为草菇成熟衰老（特别是开伞）的调控研究提供数据支持。     

信息素信号通路基因在斑玉蕈生长发育过程中的差异表达

为了更清楚地了解斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育的过程,本研究对不同菌丝培养时期的栽培瓶进行出菇实验,并对其不同培养时期和生长发育关键时期的信息素通路基因进行差异表达分析,以期揭示信息素信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体形成和发育的作用。研究结果表明：斑玉蕈菌丝培养40-80d过程中,子实体产量呈上升的趋势,说明菌丝的成熟程度对产量会产生重要影响。对斑玉蕈基因组中的信息素信号通路基因进行分析鉴定共获得了8个关键基因。信息素通路基因差异表达分析表明：在菌丝培养40-80d过程中,大部分信息素信号通路基因在第60天时表达量最高,其中ste20、cdc24和ste12上调了4-20倍,而在第80天出现下降。从菌丝恢复到扭结形成原基和子实体发育的过程中,大多数基因在原基时期表达量最高,其中ste20、cdc24、ste11和ste12表达量上调最为显著,在子实体成熟期这些基因表达量下降。因此,这说明在菌丝营养生长过程中,在第60天菌丝细胞增殖生长最为旺盛,而在第80天菌丝细胞基本停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时,在菌丝生殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调信息素通路基因表达使菌丝细胞不断地分裂增殖,从而使新生的菌丝扭结形成原基,其中ste3、ste20、cdc24、ste11和ste12基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和诱导子实体形成起到关键的作用。     

CWI和HOG信号通路基因在斑玉蕈不同发育阶段的表达模式

为了更清楚地了解MAPK信号通路中的细胞壁完整性信号通路（cell wall integrity,CWI）和高渗透压甘油（high-osmolarity glycerol pathway,HOG）信号通路对斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育过程的影响及调节作用,对MAPK信号通路中的CWI和HOG信号通路基因在斑玉蕈不同菌丝培养时间（40、60、80和100d）和不同生长发育关键时期（24h、菌丝恢复期、菌丝转色期、原基期和子实体期）的表达模式进行分析,以期揭示这两条信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体的形成和发育的作用。在斑玉蕈的CWI和HOG信号通路中经分析鉴定一共获得了15个关键基因。CWI信号通路基因表达分析表明：在菌丝培养的40-100d的过程中,大部分CWI信号通路基因在第60天时表达量最高,其中rho1、ssk1、ssk2和ste20的基因表达量上调了2-5倍,在第80-100天时出现持续下降。在HOG信号通路中的大部分基因也在菌丝培养的第60天表达量达到最高。其中sho1、ste20、ssk1和ssk2基因的表达量上调最为显著,而hog1基因的表达量在菌丝培养的第40-100天呈持续下降。子实体形成过程中两条通路的大部分基因在原基形成时期表达量最高,而在子实体时期表达量下调。其中HOG信号通路中的ssk2基因表达量上调最为显著。以上结果说明在菌丝生长过程中第60天时菌丝细胞生长增殖最为旺盛,而在第80天开始菌丝细胞基本开始停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时在菌丝增殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调CWI信号通路基因的表达来调控菌丝细胞壁的完整性,从而控制菌丝细胞壁的形成。其中bck1、mkk1和slt2基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和细胞壁的形成以及诱导子实体形成起到关键作用。     

沙葱萤叶甲卵滞育的转录组学分析

【目的】建立沙葱萤叶甲Galeruca daurica滞育卵转录组数据库,挖掘卵滞育相关的基因以及代谢和信号通路,在转录组水平探讨卵滞育的分子机制。【方法】采用Illumina NovaSeq6000高通量测序平台对沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵进行转录组测序,并进行生物信息学分析;利用DESeq软件分析沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵中的差异表达基因,对差异表达基因进行KEGG通路富集分析;利用qRT PCR技术对10个差异表达基因的表达模式进行验证。【结果】基于沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵转录组测序结果,共获得53 389个unigene,其中差异表达基因2 145个,24个差异表达基因与保幼激素信号及脂肪酸生物合成和降解相关。与解除滞育卵相比,滞育卵转录组中1 297个基因上调表达,富集于124条KEGG通路,其中核糖体通路显著富集;848个基因下调表达,富集于73条KEGG通路,其中MAPK信号通路和糖胺聚糖生物合成通路显著富集。qRT-PCR结果表明,随机选取的10个差异表达基因的表达趋势与RNA-Seq转录组测序结果完全一致。【结论】保幼激素,脂肪酸生物合成和降解,核糖体,MAPK信号及糖胺聚糖生物合成等通路可能在沙葱萤叶甲卵滞育调控中起着重要的作用。     

刺芹侧耳不同发育时期的转录组差异分析

为了探讨刺芹侧耳子实体生长发育时期的基因表达变化,本文利用高通量测序技术对刺芹侧耳不同发育时期（菌丝期、原基期、子实体时期）进行RNA-Seq分析,在转录水平上解析差异表达基因在刺芹侧耳生长发育过程中的作用和功能。KEGG功能富集显示,菌丝期差异表达基因主要富集在碳代谢和氨基酸代谢中,其中三羧酸循环中编码柠檬酸合酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的基因表达量均上调,说明碳代谢和氨基酸代谢是菌丝时期的主要能量来源;原基期上调的差异表达基因主要富集在脂肪酸代谢,其中RT-PCR定量结果显示原基期编码脂肪酸合酶的基因和编码脂酰辅酶A合成酶的基因下调,编码超氧化物酶的基因和编码过氧化氢酶的基因上调,表明脂肪酸代谢和抗氧化酶对刺芹侧耳原基期维持机体的稳定和生物应激方面起着重要作用。子实体时期上调的差异表达基因主要富集在剪接体、类固醇的生物合成以及AMPK信号通路中,说明环境因子对子实体时期有一定的影响。     

金针菇菌柄发育的转录组与蛋白组分析

菌柄是金针菇等食用菌的主要商品部位,但其生长机制仍不明确。本研究对金针菇伸长期和成熟期菌柄进行了转录组联合蛋白组分析,结果显示,两样本显著性差异表达基因和蛋白分别为721个和61个,均以上调表达为主。GO（gene ontology）功能聚类分析表明：有72.41%的差异表达基因富集在催化活性（catalytic activity）条目下。细胞组分（cell part）和绑定结合（binding）条目同时富集了较多的差异表达基因和蛋白。KEGG通路富集分析显示：碳水化合物代谢通路（carbohydrate metabolism）和氨基酸代谢通路（amino acid metabolism）富集的差异表达基因较多。差异表达蛋白富集较多的通路是单环菌素生物合成（monobactam biosynthesis,ko00261）、链霉素生物合成（streptomycin biosynthesis,ko00521）和有机含硒化合物代谢（selenocompound metabolism,ko00450）等。内质网蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum,ko04141）和MAPK信号通路（MAPK signaling pathway-yeast,ko04011）在转录组和蛋白组的KEGG富集分析中均为差异通路。本研究联合转录组和蛋白组数据筛选了40个金针菇菌柄发育中差异表达基因,为深入研究揭示食用菌菌柄发育过程提供候选基因。     

金针菇HMG-box转录因子鉴定及一个候选基因的差异表达分析

食用菌的原基形成受到环境因子和内源基因的共同调控,转录因子在其生长发育过程中能够起到关键作用。本研究在已测序金针菇单核菌株L11全基因组中鉴定到29个高速泳动蛋白（high-mobility-group box,HMG-box）转录因子编码基因。基于金针菇双核菌株H1123各发育时期转录组数据,筛选到一个与金针菇原基形成相关的HMG-box转录因子基因Fv-hmg。通过同源比对发现Fv-hmg的DNA序列在6个不同金针菇菌株中十分保守,一致性为98.38%,有92个SNP位点。克隆分析表明,该基因长度为1 517bp,含有一个内含子。该基因编码489个氨基酸残基的蛋白序列,含有一个HMG-box结构域。通过实时荧光定量PCR和转录组测序共同分析表明,该基因在金针菇原基时期的表达量比双核菌丝时期高达4倍以上,具有显著性差异（P<0.01）,由此推测该转录因子参与调控金针菇的原基形成。HMG-box转录因子Fv-Hmg在金针菇原基形成过程中的作用仍需进一步研究。     

基于转录组分析高温抑制广东虫草原基形成的调控网络

在大型真菌原基形成和子实体发育的过程中,温度是一个极其关键的因素,高温显著影响多种食用菌原基的形成和子实体的品质。广东虫草是中国华南地区特有的虫草类新食品原料,其子实体富含多种活性成分和营养成分,且能够进行较大规模人工栽培。然而,温度对广东虫草原基形成的影响及调控机制尚不清楚。本研究通过不同温度处理不同时间段,发现29℃处理3d抑制了广东虫草原基的形成;对29℃处理3d处理前后的菌丝阶段（CK）和原基阶段（CK-P和HT-P）样品进行转录组测序分析,高温处理后原基阶段的两个组中发现1 682个差异表达基因,其中1 015个上调表达和667个下调表达。在碳水化合物代谢途径中,多个糖酵解和三羧酸循环及葡聚糖和海藻糖合成相关基因在高温处理后呈现下调表达;在原基样品中,多个热激蛋白基因（Hsp10、Hsp23、DnaJ、Hsp70、Hsp90和Hsp98）和转录因子C2H2转录水平显著上调表达。本研究结果基于分子水平揭示了高温影响原基形成过程中能量代谢和相关基因的差异表达,为后续利用广东虫草抗逆相关基因资源培育新品种奠定了重要的基础。     

RNAi法分析广东虫草热激蛋白40 CgDnaJ05基因功能

DnaJ蛋白(热激蛋白40)在机体生长发育和适应逆境环境过程中起着重要作用。以广东虫草GDGM30035为材料,克隆获得CgDnaJ05基因,CDS为2 361 bp,编码786个氨基酸,生物信息学分析结果表明CgDnaJ05蛋白含有DnaJ蛋白结构域,属于碱性、不稳定和亲水性蛋白质。以CgDnaJ05蛋白DnaJ保守结构域240 bp的反向互补片段为干扰片段,构建CgDnaJ05基因的双向启动子沉默载体;通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化法侵染广东虫草菌丝,筛选获得9个相对稳定的CgDnaJ05沉默转化子。qRT-PCR分析表明,转化子CgDnaJ05相对表达量下调至野生型菌株的20%-82%;与野生菌丝相比,转化子菌丝生长速度显著下降,且CgDnaJ05下调越明显,菌丝减缓速度越显著,同时,转化子原基的形成受到显著抑制。研究表明：广东虫草CgDnaJ05基因明显影响广东虫草菌丝生长和原基形成,对广东虫草生长发育具有重要的调控作用。     

桑树桑黄菌丝体和子实体基因差异表达分析

通过对桑树桑黄Sanghuangporus sanghuang菌丝体和子实体2个不同生长阶段的转录组进行分析,为研究桑黄子实体生长发育相关机制奠定基础。采用Illumina测序技术,对桑树桑黄菌株S23菌丝体和子实体2个不同生长发育阶段进行了全转录组测序。将转录组测序reads比对到参考序列上,菌丝体测序样本的reads比对率为82.89%;子实体测序样本的reads比对率为83%。基因差异表达分析显示,与菌丝体相比,子实体中显著上调表达基因为2 898个,显著下调表达基因为1 965个。经过Blast nr比对发现,桑黄菌在子实体阶段表达量上升的基因主要与各种氧化酶活性、疏水蛋白等相关;表达量下降的基因主要与糖类、氨基酸结合、运输等相关。基因本体（gene ontology,GO）富集分析表明,菌丝体及子实体两个阶段与跨膜转运相关的差异表达基因富集明显。代谢通路（pathway）富集分析表明,类固醇生物合成、精氨酸生物合成、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路等差异基因富集明显。     

机械损伤对糙皮侧耳原基形成的影响

原基期是糙皮侧耳Pleurotus ostreatus发育进程的关键时期。本研究以糙皮侧耳菌株New 831为试验材料,通过对糙皮侧耳菌丝机械损伤,探讨机械损伤对糙皮侧耳原基诱发的影响。菌丝满板后,经过机械损伤处理,到原基期每隔4d取样一次,测定了这些样品处理组与对照组的活性氧及脂质过氧化水平,并且通过荧光定量分析了Po.WC-1、Po.WC-2、fst3和fst4基因的表达量。结果表明：机械损伤组和对照组的活性氧水平随时间的增加均呈现“先升后降”的趋势,机械损伤总体提高了活性氧的水平,并且机械损伤导致原基提前形成,表明活性氧水平的提高,可能促进了糙皮侧耳原基形成;荧光定量分析发现糙皮侧耳菌丝机械损伤处理后,Po.WC-1、Po.WC-2、fst3、fst4基因的表达量均发生变化,这些基因的变化表明它们可能参与调控糙皮侧耳原基形成;Po.WC-2和fst3基因在第8天时的显著上调表达可能促进了糙皮侧耳原基形成。研究结果表明机械损伤能够促进糙皮侧耳原基提前形成,这将为进一步研究原基形成过程中机械损伤的作用机制奠定基础。     

梯棱羊肚菌镉胁迫响应基因ATX1功能分析

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种可以大田覆土栽培的珍稀食用菌,而土壤重金属污染状况日益严重,对梯棱羊肚菌菌丝生长和子实体产品质量安全构成了潜在的威胁。本研究先采用镉离子胁迫处理梯棱羊肚菌菌丝体,RT-PCR检测发现候选基因ATX1的表达量显著下调。克隆梯棱羊肚菌ATX1基因,对ATX1p蛋白结构进行功能预测,发现ATX1p可能与铜离子转运及重金属胁迫相关。然后分别构建ATX1的超表达和RNAi基因沉默载体,采用农杆菌介导的转化方法,将其转入梯棱羊肚菌同核体菌株A50中,分别筛选到4个ATX1表达显著上调的超表达转化子和4个ATX1表达显著下调的RNAi基因沉默转化子,镉敏感性检测发现ATX1的RNAi基因沉默转化子表现为镉抗性增强,而ATX1超表达转化子则表现为镉抗性减弱。结果表明,梯棱羊肚菌ATX1基因表达与镉抗性呈负相关,ATX1p可能在梯棱羊肚菌镉胁迫响应过程中发挥着某种重要作用。     

过表达漆酶基因Lelcc1的香菇菌株构建及表型分析

真菌漆酶（laccase）是一种多酚氧化酶,在真菌生长发育中具有重要作用。本研究采用根癌农杆菌介导转化的方法,以香菇Lentinula edodes菌株W1为受体菌株,在Leactin基因启动子调控下过表达Lelcc1基因;对其中7个单拷贝插入的转化子进行qRT-PCR分析,7个Lelcc1基因表达量较出发菌株W1均上调了1.5-8倍。进一步分析了这7个转化子的遗传稳定性;挑取了3个稳定的转化子进行表型分析,主要包括不同培养基中的生长速度、代料栽培过程中菌棒转色程度、以及透射电镜观察菌丝细胞的超微结构。发现转化子和受体菌株W1的生长速度无显著差异,但代料栽培过程中转化子较W1转色更快,菌棒表面颜色更深;透射电镜观察菌丝细胞的超微结构发现在细胞壁厚度、细胞膜形态等方面,其中两个超量表达转化子与W1间存在显著差异。结果表明,香菇Lelcc1基因可能参与了转色过程中色素合成或积累,也可能与细胞壁形成有关。     

农杆菌介导双孢蘑菇AS2796转化体系的优化

双孢蘑菇Agaricus bisporus是一种药食皆宜的食用真菌,具有极高的经济价值,近年来在双孢蘑菇全基因组测序完成后,功能基因组学的研究逐步提上日程。其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。农杆菌介导的遗传转化体系作为一种高效的功能基因组研究方法,在双孢蘑菇中已经得到了广泛的应用,但是仍然存在着效率较低的问题有待解决。为了提高双孢蘑菇的农杆菌转化效率,找到双孢蘑菇遗传转化的最优条件,本实验首先对双孢蘑菇的潮霉素抗性压力进行了筛选,结果显示20mg/L的潮霉素浓度可以抑制菌丝生长,而50mg/L的潮霉素浓度则可以完全抑制菌丝生长。其次,对农杆菌菌株、菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、菌丝培养时间以及浸染时间做了L16（4 ⁵）的正交实验,通过对各因素影响的分析,得出对转化效率影响最大的因素为菌丝培养时间和农杆菌菌株,且当菌株为LBA4404、菌液浓度OD₆₀₀=0.8、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L、菌丝培养时间为40d、浸染时间为10min时,农杆菌介导的双孢蘑菇遗传转化效率最高。