鸡肝6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2-,6-二磷酸酯酶单克隆抗体制备及对酶活力影响

利用鸡肝-6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase)的单克隆抗体对其结构和功能进行了初步研究.用鸡肝6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase为抗原免疫Balb/C小鼠,最后获得7株单克隆抗体.其中6株抗体的抗原决定簇位于6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase的酯酶结构域部分,而另一株H₂的抗原决定簇则位于其激酶结构域部分.7株单克隆抗体都能引起鸡肝6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase的激酶活力提高2倍左右,而对酯酶活力的影响大致相同.它们激活该酶的酯酶活力至4倍左右,但却不影响分离的鸡肝果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域的酯酶活力.以上结果再次提示6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase双功能酶和分离的Fru-2,6-P₂ase结构域的酯酶处于2种不同的构象和活性状态.     

异烟肼耐药结核分枝杆菌感染人源巨噬细胞的蛋白质组学研究

利用双向电泳技术,对人源巨噬细胞U937感染异烟肼耐药结核分枝杆菌前后的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中产生差异的有32个蛋白质斑点,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中5个表达明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱,通过在数据库中进行检索分析,确定这5个蛋白质分别为热休克蛋白105_β、凋亡抑制蛋白-1、磷酸甘油酸变位酶1、组织蛋白酶B、桥粒胶蛋白3.上述发现有助于了解耐药结核分枝杆菌入侵早期导致的巨噬细胞蛋白质组表达变化,为深入研究耐药结核分枝杆菌-宿主相互作用提供了探索方向.     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定*

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg/LK₂Cr₂O₇,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、     

脓肿分枝杆菌MBT结构鉴定与比较演化分析

【背景】作为临床最常见的非结核条件致病分枝杆菌,脓肿分枝杆菌(Mycobacteroides abscessus)因其天然、多耐药等特性成为目前临床治疗的一大挑战。作为分枝杆菌限制性营养元素——铁摄取的关键系统,分枝杆菌素(mycobactin,MBT)、羧基分枝杆菌素(carboxymycobactin,cMBT)与病原分枝杆菌的毒力、耐药等密切相关。【目的】丰富分枝杆菌MBT、cMBT结构数据,探究MBT在致病分枝杆菌起源过程中的演化规律。【方法】在MALDI-TOF-MS与FT-MS/MS解析脓肿MBT、cMBT结构的基础上,进一步开展其活性分析与生物合成基因簇比较基因组分析。【结果】虽然脓肿分枝杆菌MBT、cMBT母核修饰模式与海洋分枝杆菌最相似,R1、R2、R3、R5等位置的修饰完全相同,而且脂肪酸链均位于R4位置;但脂肪酸链长度不同[C10-17 (MBT)、C4-8 (cMBT)],为新结构。Fe-cMBT不仅以浓度依赖方式促进脓肿分枝杆菌生长,而且利用效率显著高于FeCl₃,相关结果表明MBT-cMBT是脓肿分枝杆菌高效获取铁元素的关键系统。与MBT结构结果一致,mbt-1基因簇共线性分析及mbt-1、mbt-2系统发育分析结果均表明脓肿分枝杆菌与海洋分枝杆菌(M.marinum)亲缘关系最近,而非结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或耻垢分枝杆菌(M.smegmatis) (基于16S rRNA基因序列分析)。进一步分析发现,M.marinum、M.tuberculosis、M.bovis等病原分枝杆菌脂肪酸链长度变化范围仅4 C,而M.abscessus、M.fortuitum、M.avium和M.smegmatis等条件致病与非致病菌的脂肪酸链长度变化范围为7-11 C,暗示MBT同系物脂肪酸链长度变化范围与分枝杆菌不同生活方式、环境之间可能存在关联。【结论】作为获取铁元素的关键系统,具有独特结构的脓肿分枝杆菌MBT-cMBT在致病、耐药等方面的作用及起源、演化规律值得深入研究。     

选育抗老化啤酒酵母提高啤酒风味稳定性的研究

对一株啤酒酵母青②进行紫外线诱变 ,在蛋氨酸浓度为 15g L的耐性平板上筛选获得一株A₂₇菌株。为使A₂₇菌株的蛋氨酸耐性特征稳定遗传 ,在 11℃、稀释率为0.035h^-1 的条件下对A₂₇菌株进行高浓度蛋氨酸 (20g/L)连续驯养 ,然后分离得到一株M^I₄菌。在锥形瓶中连续发酵5代后 ,与A₂₇菌株相比 ,M^I₄ 菌株发酵液中GSH浓度高44% ,TBA值低 24% ,主酵液RSV值高 77% ,且遗传稳定性明显提高 :连续传代 5次后 ,M^I₄ 菌株胞内GSH含量基本不变 ,而A₂₇菌则下降了22%。在相同的糖化和发酵工艺条件下 ,对优选株M^I₄和出发株啤酒酵母青②进行 1m3发酵罐中试。与出发株青②相比 ,两者的总高级醇与酯量几乎不变 ,常规指标没有显著差别 ,品尝风味也基本一致。但M^I₄菌株发酵液中GSH浓度提高了 30% ,TBA值降低了19% ,成品啤酒的RSV值则提高了92% ,表明优选株M^I₄是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母 ,能够提高啤酒的风味稳定性.     

具抗真菌活性的海洋霉菌的筛选和初步研究*

从中国南海海底沉积物与海水样品中分离出100多株海洋霉菌;以条件性致病真菌白色假丝酵母(Candidaalbicans),植物病原真菌镰刀菌(Fursariumsp.)等作为敏感测试菌株,初筛分离到30多株对上述测试真菌具有明显抑制作用的海洋霉菌;对其发酵液进行复筛,发现其中编号分别为B₄^#-6、B₄^#3-、1B₆-6、1B₆-10-5、1-B相似文献   

2017–2019年中国南方五省规模化养猪场副猪格拉菌血清型、耐药性及β-内酰胺类耐药基因bla-TEM分子特征分析

【目的】旨在分析当前规模化养殖场副猪格拉菌(Glaesserella parasuis)优势血清型、耐药特性、耐药基因与分子特征。【方法】对源自规模化养猪场21株副猪格拉菌临床分离株,采用PCR鉴定血清型;利用K-B纸片扩散法鉴定其对25种抗生素的耐药表型;采用PCR检测bla-_TEM、bla-_NDM和bla-_CTX等7种耐药基因,并采用Chi-square test和Fisher exact test分析耐药表型和耐药基因型的相关性;耐药基因目的条带测序,并应用CLC Sequence Viewer软件分析β-内酰胺类耐药基因(bla-_TEM)编码蛋白氨基酸关键位点差异与耐药性的关系。【结果】21株副猪格拉菌临床分离株的优势血清型为4和12型;对β-内酰胺类药物苯唑西林的耐药性较强,耐药菌占比达61.9%(13/21);多重耐药菌株占比高达90.5%(19/21);β-内酰胺类耐药基因bla-_TEM携带率较高(52.4%,11/21),且bla-_TEM与β-内酰胺类药物青霉素G、苯唑西林和头孢拉定的耐药性显著相关,部分bla-_TEM编码氨基酸存在可能与副猪格拉菌耐药能力有关的差异位点。【结论】本研究表明,规模化养猪场的副猪格拉菌多重耐药情况仍很严重,并明确了被调查区域β-内酰胺类药物耐药率高的主要原因是携带耐药基因bla-_TEM,为加强对规模化养猪场副猪格拉菌耐药性监测提供理论依据。     

伤寒沙门氏菌的裂解气相色谱分析

本文应用裂解气相色谱法分析15株伤寒沙门氏菌(其中标准株1株,临床株14株)的色谱图,结果表明,临床株裂解气相色谱图分为A和B两类。A类(7株)色谱图完全相同;B类(7株)色谱图仅相似,但按其差异又可分为B₁组(4株),B:组(2株)和B,组(1株)。组内色谱图完全相同。B₁组图谱更接近于标准株。裂解图谱与血清型和抗药谱之间未发现有规律性的联系,但它们为伤寒沙门氏菌的鉴定和色谱图库的建立提供了有益的参考。     

耐辐射奇球菌dps突变株的构建和蛋白功能初步研究

Dps(DNAprotection during starvation)蛋白是原核生物中特有的一类具有铁离子结合和抗氧化损伤功能的重要蛋白。利用体外PCR扩增技术和体内同源重组方法,获得了耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)dps全基因(DRB0092)缺失突变株。对突变株和野生型分别进行不同浓度过氧化氢(H₂O₂)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,dps突变株在低浓度H₂O₂(≤10mmol/L)条件下存活率急剧下降,而高浓度(≥30mmol/L)下则完全致死。Native-PAGE活性染色结果显示,稳定生长期dps突变株体内两种过氧化氢酶(KatA和KatB)的活性较野生型R1分别上调2.3倍和2.6倍。通过质粒构建和大肠杆菌诱导表达,获得可溶性Dps蛋白。体外结合和DNA保护实验结果显示:Dps具有明显的DNA结合功能,并能保护质粒DNA免受羟自由基攻击。本研究证明,Dps蛋白在耐辐射奇球菌抗氧化体系中发挥重要作用,可能对该菌极端抗性机制有重要贡献。     

模拟不同降雨时间格局下喀斯特垂直异质生境对桢楠幼苗光合和生长的影响

由于岩石裸露、地表破碎、坡度陡峻、洼地土壤堆积等因素的共同作用,喀斯特区域土壤具有明显的不连续性和高度异质性,土壤侵蚀往往较为严重。喀斯特地区高度异质性的生境为植物提供了不同的水分、肥料、空气和空间,对植物的生长和生理具有显著影响。在全球气候变化下,降雨时间格局的改变可能将进一步加剧喀斯特的生境异质性。桢楠是我国特有的国家二级保护树种,虽然它只零星分布在喀斯特地区,但由于它能在岩石间生长得很好,仍被认为是一种可能的适宜树种。以二年生桢楠（Phoebe zhennan S.Lee）幼苗为研究对象,研究总降水量相同条件下两种降雨时间格局（I_2d：2 d降雨间隔;I_19d：：19 d降雨间隔处理）和三种垂直异质小生境（S₀：无石全土,S_1/2：半石半土,S_3/4：多石少土）对其光合生理和生长的影响。结果显示：（1）在I_2d条件下,桢楠幼苗的光合速率在半石半土生境（S_1/2）下最大,且有较大的地径和株高;而在I_19d条件下,桢楠的光合和生长（株高和地径）均随着岩溶裂隙层的增厚逐渐减小。（2）在全土生境（S₀）下,降雨时间格局的改变并不影响桢楠的光合和株高,而在有岩溶裂隙层的生境下（S_1/2和S_3/4）,降雨时间间隔的延长会抑制桢楠的光合和株高及地径的生长,提高气孔密度,且这种抑制或促进作用会随着岩溶裂隙层的增厚而加剧。研究表明,在降雨间隔时间短,降雨均匀充足时,有少量的岩溶裂隙能够促进桢楠的生长和光合,但降雨间隔时间延长后,这种作用丧失。另一方面,在土壤相对较厚时,降雨时间间隔的改变对桢楠的光合和生长影响不显著,但岩溶裂隙层的增加,加剧了降雨时间间隔增大对桢楠光合的负面影响。     

原发性胆管色素结石患者胆汁中大肠杆菌优势血清型的分析及各亚型产生的β-葡萄糖醛酸酶活性比较

摘要 目的：对原发性胆管色素结石患者的胆管胆汁中大肠杆菌的各个亚型产生的β-葡萄糖醛酸酶活性进行对比,进而探究导致色素结石形成的大肠杆菌优势血清型。方法：选取原发性胆管色素结石患者70例,术中无菌条件下抽取胆管胆汁行细菌培养,进行菌种鉴定及药敏试验。采用玻片凝集法鉴定胆汁中培养出的大肠杆菌的血清型,根据β-葡萄糖醛酸酶的活性与β-葡萄糖醛酸酶同底物4-硝基苯-β-D-葡萄糖苷（PNPG）反应的速率k呈正比,与反应体系的OD₆₀₀值成反比,计算大肠杆菌各亚型产生的β-葡萄糖醛酸酶活性。结果：共获得胆管胆汁标本70例,61例细菌培养阳性,阳性率为87.14%。共获得菌株73株,培养结果排名第1为大肠杆菌（34.25%）,药敏试验敏感度前5位的药物分别为阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、培南类、替加环素、头孢哌酮/舒巴坦,耐药率前5位的药物分别是四环素、左氧氟沙星、氨苄西林、氯霉素、复方新诺明。对培养出的25株大肠杆菌进行血清型鉴定,共获得13种大肠杆菌血清型,位列前3位分别为O₃₀、O₂₄、O₇₉,而O₂₄血清型大肠杆菌其时间-吸光度值曲线斜率k值明显高于其它血清型,结合其OD₆₀₀值,可得出其产生β-葡萄糖醛酸酶的活性较高。结论：原发性胆管色素结石的患者胆管胆汁中最常见细菌为大肠杆菌,血清型以O₃₀、O₂₄、O₇₉为主,其中O₂₄型血清型大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸酶的活性较高。     

早春短命植物鸢尾蒜和准噶尔鸢尾蒜的光合途径

该研究以鸢尾蒜属两种早春短命植物准噶尔鸢尾蒜(Ixiolirion songaricum)和鸢尾蒜(Ixiolirion tataricum)为对象,通过解剖结构、光合参数、稳定碳同位素比值(δ¹³C)和光合关键酶活性分析二者的光合途径。结果发现：(1)显微结构和超微结构显示,两种短命植物的叶脉维管束鞘细胞1层、排列较紧密,鞘细胞内含有较多叶绿体且多离心分布,类似C₄花环结构。(2)准噶尔鸢尾蒜和鸢尾蒜最大净光合速率分别为14.81和15.04 μmol·m^-2·s^-1;两者的CO₂补偿点较低,分别为3.57和2.54 μmol·mol^-1,δ¹³C分别为-25.36±0.55‰和-25.76±1.38‰,光合酶PEPC/Rubisco比值分为别0.244和0.322。(3)最大净光合速率、δ¹³C和PEPC/Rubisco比值均说明两种植物为C₃光合途径,但二者均具有类似C₄的维管束鞘结构、较低的CO₂补偿点和暗呼吸速率,并具有高于部分C₃和C₃ C₄中间型植物的PEPC/Rubisco比值,表明两种短命植物的光合途径并非典型的C₃途径,而是C₃ C₄中间型。     

重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定

人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI_1-161仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒Pgem 3Zf(-) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI_1-161 基因 ,构建表达质粒Ppic9k TFPI_1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI_1-161,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 20倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI_1-161 表达为TFPI1_1-161 (2 4kD)和TFPI_1-161 (27kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4.8和 4.9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1.4gTFPI_1-161(2.4kD)和1.8gTFPI_1-161 (2.7kD) ,其比活性分别达12880u/mg和12400u/mg.回收率达55%.经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测,重组FTPI_1-161具有良好的抗凝及抑制Fxa活性的作用。为获得大量TFPI_1-161提供了一种廉价高效的的蛋白表达纯化方式。为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白T的纯化和单克隆抗体的制备

从人左室心肌中成功纯化心肌肌钙蛋白T(cTnT). 经匀浆, 70℃加热处理, 咪唑盐酸透析, DEAE-纤维素层析, 100g心肌获取cTnT 5mg, 纯度为97.6%. 同时采用脾内免疫法, 免疫Balb/C小鼠, 经细胞融合, 筛选, 克隆化得5株稳定分泌抗人cTnT单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(G₃, G₈, G₁₀, A₅, A₇), 4株为IgM, 1株为IgG, 染色体数目92～110条. 腹水效价为3.2×10^-6～1. 6×10^-7.     

原生质体融合技术构建糖化型啤酒酵母的研究

融合亲株B_6-5（Ala^-,Cys^-α）和T_3-4（His,Thr^-α）细胞于35％PEG（6000）－50mmol／LCaCl₂溶液,28℃下诱导融合30min,筛选出融合株,融合频率为6．2×10^-5。融合株细胞的体积和DNA含量均为两系株细胞之和。融合株有水解淀粉的能力,又有发酵度高于生产用酵母的特点。     

人酪酪肽及其衍生物的克隆、表达及活性测定

酪酪肽(peptide tyrosine tyrosine, PYY)是存在于机体肠道的肽类激素,有 PYY_1-36和PYY_3-36两种形式,后者可以降低个体食欲并减少食物摄入。分别通过人工合成基因和PCR定点突变的方法,得到PYY_3-36衍生物PYY_3-36-Gly³⁷及PYY_3-36的基因,然后克隆到pET32a(+)表达载体中,转化大肠杆菌并进行诱导表达。通过亲和层析得到融合蛋白,经肠激酶酶切和二次亲和层析得到目的多肽。在昆明鼠体内检测二者生物活性,结果显示剂量为800μg/kg时PYY_3-36及PYY_3-36-Gly³⁷均可抑制昆明鼠的摄食,且抑制作用可达9h,而PYY_3-36-Gly³⁷组的平均抑制率可达50%,明显高于PYY_3-36。     

NaHCO3胁迫对紫根水葫芦形态学指标和光合参数的影响

为研究NaHCO₃胁迫对紫根水葫芦的形态学指标及光合参数的影响,该文以紫根水葫芦为材料,采用不同浓度碱性盐NaHCO₃溶液处理成株紫根水葫芦,测定在NaHCO₃胁迫下紫根水葫芦的植株株高、根长、根冠比、生物量、含水量和光合参数[净光合速率(P_n)、胞间CO₂浓度(C_i)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)]。结果表明:紫根水葫芦在20 mmol·L^-1 NaHCO₃浓度下的水溶液pH值最为平缓; 在低浓度NaHCO₃溶液中(≤40 mmol·L^-1),相比CK,紫根水葫芦的形态学指标呈现增长或无显著影响情况,而在高浓度NaHCO₃溶液中(≥60 mmol·L^-1),随着NaHCO₃浓度的升高,紫根水葫芦形态学指标显著降低,且与NaHCO₃浓度呈负相关; NaHCO₃胁迫对紫根水葫芦的光合参数影响显著,随着NaHCO₃浓度的增加及试验处理时间的延长,紫根水葫芦的P_n呈持续下降的趋势,C_i、T_r和G_s整体呈上升趋势,其光合作用受到的主要是非气孔限制。综合分析显示,紫根水葫芦具有一定的耐NaHCO₃能力,能正常生存在不超过40 mmol·L^-1 NaHCO₃浓度的水体中,且能改善低NaHCO₃浓度下的水体pH值。     

假单胞菌S-59对多种染料的脱色和降解

从受染料长期污染的污泥样品中分离到28株对多种染料具有脱色能力的细菌,其中一株假单胞菌S-59号菌对79种染料均有脱色作用。该菌对酸性红B 2GL (简称酸性红B)和活性桔K₂GV的脱色活力高达4.48—4.43mg(染料)·g^-1(细胞湿重)·h^-1。对阳离子红2GL和酸性红B在浓度为1×10^-1mol/L时其半脱色时间只有0.5小时。染料浓度在100 mg/L以上时会抑制菌的脱色率,而对菌生长的抑制作用则取决于不同     

白头鹎的的体温调节与蒸发失水

采用开放式呼吸测定仪和数字式温度测量仪,在环境温度为5.0~35.0℃范围内,测定白头鹎的体温、代谢产热和蒸发失水(EWL),并计算其热传导等生理生态特征。结果表明：白头鹎的热热中性区为25.0~32.0℃;基础代谢率(BMR)为(3.67±0.03)ml O₂ g_-1 h_-1,是体重预期值的64%。平均最小热传导为(0.15±0.00)ml O₂ g_-1 h_-1 ℃_-1,是体重预期值的124%。蒸发失水与产热的比率(EWL/RMR)在5.0~35.0℃时随着环境温度的升高而升高,在35℃时达到峰值,为(1.71±0.07)mg H₂O/ml O₂。代谢水和蒸发失水的比率(MWP/EWL)随环境温度上升而下降,在16.4℃时,MWP/EWL为1。这些结果表明了白头鹎具有较低的基础代谢率和高的热传导,蒸发失水在体温调节中占有重要的地位。     

城市小型景观水体CO2与CH4排放特征及影响因素

淡水生态系统被认为是大气温室气体排放的重要来源,尤其在人类活动影响下,其排放强度可能进一步增强。城市小型景观水体是城市生态系统的重要组成,具有面积小、数量大以及人类干扰强的特征,其温室气体排放特征及影响因素尚不清楚。选择重庆市大学城8个景观水体和周边2个自然水体为对象,于2019年1、4、7、10月,利用漂浮箱和顶空法分析了水体CO₂与CH₄的溶存浓度及排放通量,旨在揭示城市小型景观水体CO₂与CH₄排放强度、时空变异特征以及影响因素。结果表明,10个小型水体CO₂、CH₄的溶存浓度范围分别为10.75-116.25 μmol/L和0.09-3.61 μmol/L（均值分别为（47.6±29.3）μmol/L、（1.13±0.56）μmol/L）,均为过饱和状态;漂浮箱法实测的8个景观水体CO₂和CH₄排放通量均值分别为（72.7±65.9）mmol m^-2 d^-1和（2.31±3.48）mmol m^-2 d^-1（顶空法估算值为（69.7±82.0）mmol m^-2 d^-1和（3.69±2.92）mmol m^-2 d^-1）,是2个自然水体的3.5-6.1和2.0-4.5倍,呈较强的CO₂、CH₄排放源;居民区景观水体CO₂和CH₄排放略高于校园区,均显著高于对照的自然水体;CO₂排放夏季最高,秋季次之,冬、春季最低,CH₄呈夏季>秋季≈春季>冬季的季节模式,温度和水体初级生产共同影响CO₂和CH₄排放的季节模式;水生植物分布对景观水体CO₂、CH₄排放有显著影响,有植物分布的水域比无植物水域平均高1.97和2.94倍;漂浮箱法和顶空法测得气体通量线性关系较好,但顶空法测得CO₂通量在春季明显偏低,而CH₄则普遍偏高。相关分析表明,景观水体碳、氮浓度、pH值以及DO等对CO₂排放具有较好的指示性,CH₄排放通量主要与水体中碳、磷浓度有关。城市小型景观水体CO₂、CH₄排放通量远高于大部分已有自然水体的研究结果,呈一种较强的大气温室气体排放源,在区域淡水系统温室气体排放清单中具有重要贡献,未来研究中应给以更多关注。