蛋白质复性研究进展

许多蛋白在大肠杆菌中高效表达时,其产物常以无活性的包含体形式存在,包含体蛋白的复性往往是制备这些蛋白的关键步骤之一,蛋白复性包括肽链折叠和分子内二硫键的氧化这两个互相影响的过程,本文综述了蛋白折叠过程的研究进展,及促进蛋白折叠和二硫键氧化的方法。     

DNA损伤反应性蛋白参与中心体调控

中心体是动物细胞有丝分裂期微管组织中心,对于细胞有丝分裂期形成纺锤体、正常分裂及染色体精确分离至关重要. 中心体失调控常造成遗传物质错误分配,最终诱发肿瘤形成.因此,对中心体结构及数量的精密调控将对细胞命运起着决定 作用.目前发现,中心体至少包含100多种调节蛋白,这些蛋白在细胞内的功能各异.最近很多研究显示,多种DNA损伤修复及 应答通路的激酶或磷酸酶定位于中心体,并且参与中心体调控.本文将对中心体结构、中心体复制、中心体分离、中心体扩 增、DNA损伤与中心体异常及DNA损伤反应性蛋白在中心体调控中的功能作一综述.     

运动蛋白介导的病毒在植物体中的传播

综述了病毒在植物寄主内扩散中的运动蛋白的作用。由病毒基因组编码的运动蛋白与病毒核酸形成运动蛋白核酸复合物,介导病毒扩散。在病毒复制与扩散过程中,运动蛋白与宿主细胞内质网、高尔基体、细胞骨架、胞间连丝发生作用,并受细胞果胶甲基脂酶、包含体、β-1,3-葡聚糖酶、磷酸化等因素的影响,形成了植物体内遗传物质系统性运输的一个模式。     

克隆基因表达产物-包含体的形成及纯化策略

目前,来自病毒、细菌和哺乳动物的许多基因已被克隆到质粒中,在启动子的调节下在E.coli中得到表达。在许多情况下,这种基因所表达的蛋白产物大部分是以一种不溶性的形式—“包含体”(inclusion bodies)存在于E.coli的胞浆之中。这种以包含体形式而存在的克隆基因产物,已引起了生物工程界的重视,因为它对生物工程的下游工作即纯化工作的影响非凡,目前对包含体的形成机制还有争议,本文将讨论这方面的进展。     

蛋白质聚集的形成与调控机制

大肠杆菌是外源蛋白质的首选表达系统,但蛋白质易被宿主细胞蛋白酶降解或聚集形成包含体。包含体与淀粉样蛋白纤维的形成过程相似,都依赖于特异性氨基酸序列的分子间相互作用。因此,淀粉样蛋白质抗聚集的方法也可用于防止细菌表达蛋白质的聚集。另外,基于序列的新型方法也能调节蛋白质聚集。     

外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的新策略

大肠杆菌是最常用的遗传工程宿主 ,但是 ,外源蛋白在大肠杆菌中表达 ,往往形成包含体。包含体的形成 ,在一定程度上限制了原核载体 宿主系统的应用 ,为了克服包含体的形成 ,目前常用的策略是分子伴侣 (如ＧｒｏＥＬ ＥＳ、ＤｎａＫ)、折叠酶系 (如ＤｓｂＡＢＣ、ＰＰＩ)、“分子内伴侣”(如Ｔｈｒｘ、ＧＳＴ、ＳＰＡ等 )甚至一些短肽的共表达或融合表达 ,上述策略虽然可以减少甚至完全避免包含体的形成 ,但都存在一定的缺点 ,如分子伴侣的作用存在明显的蛋白特异性 ,对不同蛋白辅助折叠效率不一样 ,对有的蛋白 ,甚至根本就不起作用 ,表现出…     

包含体内重组蛋白质的复性

具有临床、工业生产、药用功能的真核生物蛋白质的供给常常受到其天然来源的限制。可喜的是基因工程技术的发展使许多真核生物蛋白质能在细菌细胞中进行表达[1] 。大肠杆菌由于培养和基因操作容易而成为最受欢迎的表达系统 ,但是重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达常常导致以包含体形式存在的胞內聚集的变性蛋白质的形成。这种变性蛋白质的量可高达总的重组蛋白质量的95%。由于以包含体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构 (天然结构 ) ,它们在水溶液中通常不溶解且没有活性 ,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白…     

增强蛋白与多角体蛋白共包埋的研究

颗粒体病毒的增强蛋白（enhancin)是一种能显著提高核型多角体病毒（NPV）对昆虫感染力的病毒蛋白。构建了一种不形成多角体但表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白的重组病毒AcBBH-TnEn,将它与野生型AcMNPV共同感染SF21细胞,经SDS－PAGE、免疫印迹分析、荧光免疫等方法检测证实,增强蛋白与多角体可在同一细胞中同时表达,而且发现所形成的病毒多角体带有增强蛋白。这表明,可以通过混合感染的方式生产带有增强蛋白的病毒多角体。     

真核生物FANCJ-like蛋白的结构与进化

FANCJ-like蛋白是一类ATP依赖的5′-3′DNA解旋酶,参与DNA损伤修复、同源重组及G4-DNA拆解,在基因组稳定性维持过程中发挥重要功能。文章系统分析了47种真核生物的FANCJ-like蛋白,对其序列结构特征及起源进化进行了深入探讨。真核生物FANCJ-like蛋白包含4类成员——XPD、CHL1、RTEL1和FANCJ,但在真菌的一些世系及昆虫中存在严重缺失现象,如接合菌门(Zygomycota)缺失了RTEL1,担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)缺失了RTEL1和FANCJ,双翅目昆虫缺失了FANCJ。FANCJ-like蛋白不仅包含经典解旋酶共有HD1和HD2结构域,而且在HD1结构域中插入了自身特有的Fe-S、Arch和Extra-D结构域。Fe-S和Arch结构域在4类成员中较保守,Extra-D结构域在XPD中不存在,在其他3类成员中也各不相同。在FANCJ-like蛋白的Fe-S、Arch和Extra-D结构域中分别发现了7个、10个和2个特有模体;除了已报道的保守模体外,HD1和HD2中分别发现了5个和12个特有模体。从这些特有模体的组成和排布来看,RTEL1和FANCJ最为相近,它们在HD2区包含两个独有模体Vb2和Vc,可能与其G4-DNA解旋活性相关。进化方面的证据表明,FANCJ-like蛋白起源于一种HD1区插入了Fe-S和Arch结构域的DNA解旋酶,在多细胞真核生物出现之前,该蛋白通过3次复制事件和随后的特异化过程,依次形成了目前真核生物所包含的4类FANCJ-like蛋白。     

前体mRNA剪接蛋白Tra2β1的抗体制备及鉴定

Tra2 β1是Tra2 β前体mRNA剪接调节蛋白家族中的一个组织分布最广、表达量最多的成员 ,它在选择性前体mRNA剪接中有调节功能 ,而在基础性剪接中不是必需的 .为便于对该蛋白功能的进一步研究 ,需要制备能特异地检测Tra2 β1蛋白的抗体 .选择包含Tra2 β1的N端 12个氨基酸的特异编码序列的Tra2 β2全长编码序列 (共 117个核苷酸 ) ,将其克隆至pGEX 3X表达载体形成GST融合基因 ,并以诱导表达和纯化的该融合蛋白为抗原免疫新西兰兔 ,获得了相应的抗体 .Western印迹和免疫细胞化学分析结果显示 ,获得的抗体能特异地检测Tra2 β1蛋白     

水蕨精子发生过程中中心体蛋白和微管蛋白的免疫荧光定位

采用透射电镜技术和免疫荧光标记技术对水蕨精子发生的超微结构以及中心体蛋白和微管蛋白在精子发生过程中的动态表达进行了观察。研究发现：（1）生毛体分化早期周围有放射状微管分布,这与线粒体向生毛体的聚集有关。（2）免疫荧光观察表明,中心体蛋白仅定位于生毛体、基体和鞭毛带上,自生毛体至基体阶段呈现明亮的荧光标记,在核塑形、鞭毛形成至精子成熟阶段,中心体蛋白荧光标记随着鞭毛的发生而逐渐减弱,至游动精子阶段中心体蛋白荧光标记信号几乎消失。（3）微管蛋白早期荧光标记与中心体蛋白标记形相同,在生毛体、鞭毛带、基体等运动细胞器上呈现明亮荧光标记,但微管蛋白随着鞭毛的发生其荧光标记越来越强。从二者的时空表达特征可以推断,中心体蛋白主要是运动细胞器的组织者,而非这些运动细胞器的结构成分,其功能是参与或负责中心粒、基体和鞭毛的发生。     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

意大利蝗痘病毒与西伯利亚蝗痘病毒包涵体蛋白基因序列分析(英文)

本文报道了意大利蝗痘病毒(CiEPV)与西伯利亚蝗痘病毒(GsEPV)包涵体蛋白基因序列分析。CiEPV与GsEPV包涵体蛋白基因分别包含2922bps,2967bps的开放阅读框架,编码109.2kDa,111.1kDa蛋白质。与鳞翅目及鞘翅目昆虫痘病毒包涵体蛋白氨基酸的同源性低于20％,而与其他直翅目昆虫痘病毒包涵体蛋白氨基酸的同源性均高于80％。CiEPV与GsEPV包涵体蛋白分别包含19与21半胱氨酸位点,主要分布在C-末端,半胱氨酸位点的数目与位置均类似于其他直翅目昆虫痘病毒包涵体蛋白。此两种痘病毒包涵体蛋白基因的启动子区域基因序列保守,富含A+T并且具有典型的痘病毒晚期启动子信号TAAATG。同时在此两种痘病毒包涵体基因的下游均克隆了另一个不完整的基因序列,此基因与血黑蝗痘病毒的MSV072基因同源,并且相对于包涵体蛋白基因为反向。     

蛋白质的排阻色谱复性的新进展

外源蛋白在大肠杆菌中高效表达时 ,常常形成不溶的、无活性的包涵体 ,包涵体蛋白的复性是重组蛋白生产过程中的一个技术难题。排阻色谱 (sizeexclusionchromatography ,SEC)用于蛋白复性是一种较新的、适用于任何一种蛋白的方法 ,与常用的稀释复性法相比 ,它能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性 ,活性回收率较高 ,同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。对使用SEC复性的进展进行了评述 ,其内容包括SEC复性的原理及其复性过程中的影响因素 ,并对其未来发展进行了展望。     

包含体的体外复性策略

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体即包含体。包含体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包含体中复性重组蛋白。介绍稀释法、透析及分子排阻、固定化金属离子亲和层析、疏水层析复性等策略和进展;物理化学因素、前导肽协助蛋白折叠;人工分子伴侣辅助蛋白折叠及反胶束、多聚物用于蛋白复性。     

与朊毒体相关的鱼类朊蛋白研究概况

疯牛病(mad cow disease),即牛传染性海绵状脑病(bovine transmissible spongiform encephalopathy,BSE)的俗称,是一种慢性消耗性、致死性、中枢神经系统退行性疾病。疯牛病被认为与朊毒体(Prion)有关,朊毒体是由正常朊蛋白(Prion protein,或者PrPC)发生构象改变后形成的异常蛋白(PrPSc)。疯牛病的发生引起了世界各国政府和科学界的高度重视,PrP的起源及其功能研究已成为研究热点。鱼类PrP相关蛋白的研究正在展开中,由于鱼类PrP相关蛋白与朊蛋白的结构相似,鱼类感染TSE类似病存在理论上的风险。本文全面地综述了疯牛病的概况、朊毒体的特性、朊毒体与哺乳动物朊蛋白、鱼类PrP相关蛋白(PrP1、PrP2和PrP3)及鱼类其他PrP相关蛋白的研究情况,为国内水生动物PrP相关蛋白研究提供参考。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)DNA的提纯及多角体蛋白基因片段的克隆

本文报道了从被AcNPV感染的大蜡螟中提纯到AcNPV DNA,以质粒pBR325作为载体,从AcNPV基因组DNA EeoRI片段克隆中得到含AcNPV多角体蛋白基因片段的重组质粒。经原位杂交,酶切鉴定,DNA顺序分析,并与Hooft Van Iddekinge等人测定的结果比较,证明筛选到的7.3kb EcoRI片段包含了AcNPV多角体蛋白结构基因及其启动基因。核多角体病毒多角体蛋白启动基因是迄今为止在真核细胞中所发现的最强启动基因之一,是理想的表达外源基因的启动子。     

天花粉蛋白突变基因TCSA-S在大肠杆菌BL21中的表达

天花粉蛋白是具有N-糖苷酶活性的一种植物Ⅰ型核糖体失活蛋白,本研究用PCR方法获得了天花粉蛋白的突变基因TCSA-S,构建了表达载体pET-30a( )-TCSA-S,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在30℃条件下诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测,重组的突变体基因TCSA-S表达产物主要存在于包含体中。     

人乳头瘤病毒16型湖北株E7基因的克隆和高效表达

利用基因克隆技术,将ＨＰＶ１６湖北株完整的Ｅ７基因克隆到含乳糖操纵子的表达载体ｐＷＲ５９０１上,经限制性酶切分析获得重组质粒ｐＷＨＢＥ７。ｐＷＨＢＥ７转化大肠杆菌后表达产生分子量为７０ｋＤ的融合蛋白ｌａｃＥ７,该蛋白在免疫印迹实验中可被标准Ｅ７单抗识别。经ＩＰＴＧ诱导后,Ｅ７融合蛋白产量可达细菌总蛋白含量的３０％以上。利用ｌａｃＥ７蛋白在细菌胞浆中形成包含体的性质,简便地提取并纯化了该蛋白质。结果为从免疫学角度探讨ＨＰＶ１６与宫颈癌的关系以及ＨＰＶ疫苗的研制打下基础。     

植物TFⅢ A型锌指蛋白

在植物中发现的锌指蛋白可以分成几种类型[1] 。其中经典的锌指蛋白是ＴＦⅢＡ型锌指蛋白 ,又称Ｃｙｓ2 /Ｈｉｓ2 或Ｃ2Ｈ2 ,模体为ＣＸ2— 4ＣＸ3 ＦＸ5 ＬＸ2 ＨＸ3— 5 Ｈ ,其中的两个Ｃｙｓ和两个Ｈｉｓ与锌原子形成配位键 ,进而形成包含一个β发夹和一个α螺旋的紧密指状结构 (图 1 ) [2 ] 。曾经认为锌指结构主要介导蛋白质与ＤＮＡ的互作 ,其中α螺旋与ＤＮＡ的大沟发生接触 ,然而最近发现有的转录因子中的一些ＴＦⅢＡ锌指只与蛋白质发生互作 ,而同一转录因子中的其他ＴＦⅢＡ锌指则与ＤＮＡ发生互作。第一个在植物中发现的ＴＦⅢＡ…