大肠杆菌等受体tRNALeu的T7 RNA聚合酶转录

用化学方法合成编码 2个大肠杆菌tRNA^Leu(tRNA^Leu₁和tRNA^Leu₂ )的基因和T7启动子 ,分别克隆到pUC1 9载体上 ,并在纯化的T7RNA聚合酶的体外转录系统中转录出不含修饰核苷酸的tRNA^Leu.在T7转录体系中 ,亚精胺对转录有负影响 .在最适转录条件下 ,可以得到有活力的RNA转录物的量是模板DNA的 2 5 0倍左右 .在大肠杆菌亮氨酰 tRNA合成酶的催化下 ,2种经体外转录产生的未修饰等受体tRNA^Leu(tRNA^Leu₁和tRNA^Leu₂ )的亮氨酸接受能力基本相同 ,但只有从体内纯化对应的tRNA^Leu的四分之一左右 ,表明修饰核苷酸在tRNA^Leu氨酰化过程中起着较为重要但非关键的作用 .     

人线粒体tRNALeu(UUR)及其突变体的基因克隆、表达和纯化

将化学法合成的人线粒体tRNALeu(UUR)及其突变体(tRNALeu(M))基因分别连接到载体pGEM-9zf (-)中, 并转化到大肠杆菌JM109中得到两个转化体分别为Leu-W和Leu-M. 在IPTG的诱导下, tRNALeu(UUR)和tRNALeu(M)的表达量可达总小分子RNA的19.10%和17.76%. 经DEAE-sepherose CL4B柱层析可使它们的纯度提高3倍. 最后用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化, 并用大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶(LeuRS)分别测定了它们的氨酰化反应动力学常数. 结果显示, mtRNALeu(M)的Kcat / Km值约为mtRNALeu(UUR) 的1/5, 提示该突变可使mtRNALeu(UUR)的氨基酸接受能力明显下降.     

人线粒体tRNALeu(UUR)基因A3243G点突变对其亮氨酰化活性的影响

化学法合成人线粒体野生型与A3243G点突变型tRNALeu(UUR)基因,体外转录生成相应的tRNALeu(UUR),表达并纯化人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS),用mtLeuRS催化野生型与突变型tRNALeu(UUR)与亮氨酸结合,分别检测两种类型tRNALeu(UUR)的氨酰化动力学常数。结果表明,野生型tRNALeu(UUR)的Km/Kcat仅为突变型tRNALeu(UUR)的63.9%,A3243G点突变使tRNALeu(UUR)接受亮氨酸的能力明显下降,提示此为A3243G点突变致病机制之一。 Abstract:The wild-type and mutant-type human mitochondrial tRNALeu(UUR) genes were synthesized and transcribed in vitro with T7 RNA polymerase.The kinetic parameters of human mitochondrial leucyl-tRNA synthetase(mtLeuRS) were determined with wild-type and mutant-type human mitochondrial tRNALeu(UUR) respectively.The results show that the value of Km/Kcat of mtLeuRS for the mutant-type tRNALeu(UUR) is 63.9% as compared with the wild-type.Human mitochondrial tRNALeu(UUR) gene A3243G point mutant can remarkably reduce it′s aminoacylation activity,suggesting it would be one of the mechanisms that the mutation could produce such clinical phenotypes.     

大鼠肝tRNA~(Ile)基因的克隆与体外转录

采用PCR扩增出大鼠肝tRNAIle基因,构建了重组质粒pGWIW,并用T7RNA聚合酶／启动子系统对其进行了体外表达．经过对转录产物片段大小及运用Northernblot鉴定,证明获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNAIle生物学活性检测显示：合成基因体外转录产物氨基酰化活性是天然tRNA的40％,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ile－tRNA合成酶的识别过程中起重要作用     

siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,所合成的 5条T7siRNAs ,均能特异性地抑制萤光素酶基因的表达 ,抑制率分别为 94 31%、80 0 1%、78 0 1%、80 33%、85 6 4% ,其中以靶向HCVIRES第二茎环结构的T7siRNA1抑制率最高 ,且对HCV基因的抑制作用有剂量依赖性 ,随T7siRNA1量的增加 ,抑制率逐渐增强 .siRNA抑制HCV基因的作用具有良好的特异性 ,改变其中 1个核苷酸即无显著抑制作用 .     

用T7RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNA~(Ile)

采用PCR技术从rec M1 3mp1 8中扩增出 1 2 0bp的大鼠肝tRNAIle合成基因片段 ,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板 ,利用T7RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNAIle基因 ,生成不含修饰碱基的tRNAIle,并对体外转录反应条件进行了优化 ,回收的tRNA产量可达DNA模板量的 4 0倍     

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.     

T7启动子-11碱基突变对转录影响的研究

T7噬菌体启动子能被T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动转录 ,为研究两个系统转录的关键碱基 ,将合成的T7噬菌体启动子 1 1变异体与报道基因CAT基因连在一起。体内CAT和体外狭缝RNA杂交实验显示 : 1 1碱基是T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动T7启动子的关键碱基之一。     

锤头状核酶对转化生长因子β1 RNA的体外剪切作用

为研究转化生长因子β1（TGFβ1）在造血调控中的关键作用, 构建针对抗转化生长因子β1的锤头状核酶, 并对它的体外剪切活性进行探讨. TGFβ1 cDNA部分基因片段其克隆入T载体中, ３２Ｐ标记TGFβ1体外转录物, 变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化获得靶RNA.计算机设计抗TGFβ1的锤头状核酶, 并把合成的核酶基因片段克隆入pGEM-9Zf(-)中T7启动子的下游, 凝胶电泳纯化回收３２Ｐ标记核酶的体外转录物.在不同条件下进行核酶的剪切反应, 变性PAGE, 放射自显影.活性的Rz445在37℃时具有良好活性, Km为29.55 nmol/L, Kcat为0.1533 min－1, 突变型核酶Rz445m没有剪切活性.制备的Rz445在体外具有良好的特异催化剪切活性, 并有望胞内抑制TGFβ1表达, 从而在干细胞移植中应用.     

基于核酶技术的人线粒体色氨酸tRNA的高效转录及其活性鉴定

利用T7RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的体外转录方法因其简便、高效而在RNA制备中得到广泛应用,但该法由于T7RNAP的启动子跨越转录起始位点而会导致转录产物多出附加序列;如果去掉T7启动子的转录起始位点,则会严重降低T7RNAP的转录活性。本实验很好地消除了以上弊端,将T7RNAP的高效转录系统与核酶高度专一的自剪切技术相结合,成功构建了一种不影响转录效率的体外转录方法,而且转录后核酶能够在设计的特定位点进行自剪切并释放出目的RNA,得到了活性达113.6pmol/μg的人线粒体色氨酸tRNA(HmtRNATrp(UCA))。该方法转录效率高、重复性好,适合RNA的大量精确制备。     

SARS-CoV N蛋白与病毒mRNA相互作用的初步研究

SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新型的冠状病毒,其基因组大小约为30,000 nt,为单股正链RNA.病毒基因中的1-72个核甘酸为前导序列.核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白,它在病毒基因转录,翻译以及病毒颗粒包装中起重要作用.在本研究中,我们通过PCR的方法从SARS-CoV cDNA中克隆N基因,将基因克隆到大肠杆菌表达载体中,经表达纯化获得大量重组蛋白,通过亲和层析和凝胶过滤层析获得高纯度的N蛋白.同时构建前导RNA的转录模板,经体外转录得到地高辛标记的RNA.使用Northwestern分析技术,我们证实纯化的N蛋白在体外可以与RNA发生特异性的结合.N蛋白与病毒RNA的结合特性及其在病毒生活周期中的所起作用的初步研究,为下一步设计出有效的阻断病毒周期从而达到抗病毒目的的药物或疫苗奠定了基础.     

重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经大肠杆菌温度诱导表达后,其表达产物以包涵体形式存在,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF.在一定的实验条件下用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,所得修饰产物经分离纯化后获得PEG20K-rhG-CSF偶联物.与修饰前的rhG-CSF相比较,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高.     

转录起始于NTP，还是nanoRNAs？

20世纪80年代曾经发现,在体外,原核生物或真核生物的RNA聚合酶都可以不利用三磷酸核苷酸(nucleoside triphosphate,NTP),而利用寡聚核苷酸起始转录[1-2],但这种现象一直没有在细胞中发现.直到2011年,Goldman等[3]在革兰氏阴性菌——绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)中发现一     

siRNA降低肿瘤细胞端粒酶活性的研究

利用T7RNA聚合酶在体外转录合成针对端粒酶模板RNA(hTR)的两条互补单链RNA,经退火形成siRNA.采用TRAP法检测端粒酶活性,分析siRNA在肿瘤细胞裂解液的干扰作用.结果表明:T7RNA聚合酶可以高效地转录出短的单链RNA,制备的siRNA可明显地降低肿瘤端粒酶的活性,其降低肿瘤端粒酶活性的作用强于等量的反义链RNA.该法廉价、高效、简易,有可能为肿瘤的基因治疗提供一种新的探索途径.     

银松素合酶基因地高辛标记RNA探针的合成

目的:体外转录合成银松素合酶(PS)基因地高辛标记反义RNA探针。方法:通过双酶切把PScDNA全长序列接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;同时,经由NCBI比对确定PScDNA的特异序列,设计含有SalⅠ和XbaⅠ这2个酶切位点的上、下游引物,用PCR法扩增含有该位点的目的片段,并连接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;最后利用pBlueskriptⅡKS( )上的启动子T7,用T7RNA聚合酶在体外转录合成地高辛标记PS全长及特异序列的反义RNA探针。结果:通过对构建探针的单、双酶切,PCR及电泳鉴定,表明成功合成了PS基因地高辛标记的全长及特异序列的反义RNA探针。结论:RNA探针的合成为后续马尾松PS基因表达的RNA原位杂交研究打下了基础。     

真核基因启动子非依赖的功能转录延伸复合物的体外组装

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力对基因转录过程中每一个阶段,包括启动子脱离、转录暂停、转录终止以及转录偶联DNA损伤修复过程的调节至关重要.在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸过程中,其和模板DNA及转录产物RNA紧密结合,形成一个非常稳定的延伸三维复合物(elongationcomplex,EC).此特征性“泡”状结构的形成是RNA聚合酶Ⅱ持续合成能力所必需的.在不依赖启动子及众多转录起始因子的条件下,利用人工合成的RNA与DNA寡核苷酸,在体外组装形成具有功能转录活性的延伸复合物.结果表明,长度为9个核苷酸的RNA与模板DNA形成的杂合分子对转录延伸复合物的形成是必需的,而非转录模板DNA链的加入导致最终活性转录“泡”状复合物的形成,并可转录形成与模板相关的转录产物,进一步通过在模板DNA的特定位置引入一个乙酰氧乙酰氨基芴修饰基团,可特异性地阻断转录延伸过程,从而显示该系统在研究真核基因转录及转录偶联DNA损伤修复机制中的潜在应用价值.     

大规模合成长链RNA的简易低成本工艺

由于现有技术所限,RNA分子长度和二级结构往往成为RNA合成困难的主要原因.提供了一种简单低成本大规模制备和纯化长链RNA药物的新工艺,尤其针对具有稳定二级结构的长链RNA药物.采用引物延伸方法替代PCR和线性质粒DNA方法制备线性DNA模板可减少步骤及降低污染,然后用T7 RNA聚合酶转录制备的甲氧基修饰的线性DNA模板获得高均一度的长链RNA,转录粗产物直接用source 15Q阴离子HPLC分离T7 RNA聚合酶、rNTP、转录中断产物、内毒素和模板DNA等,从而获得高纯度RNA终产物.该工艺无需繁琐的酚/氯仿抽提和RNA变性,尤其适用于RNA的大量制备.     

用T7 RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNAIle

采用PCR技术从rec-M13mp18中扩增出120 bp的大鼠肝tRNA^Ile合成基因片段,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板,利用T7 RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNA^Ile基因,生成不含修饰碱基的tRNA^Ile,并对体外转录反应条件进行了优化,回收的tRNA产量可达DNA模板量的40倍.     

斑马鱼Gfi1.1基因的克隆及其体外转录

目的:克隆斑马鱼Gfi1.1基因的全长cDNA,运用T7 RNA聚合酶对含有Gfi1.1基因的ORF区进行体外转录,在体外合成5端带有帽子结构的Gfi1.1 mRNA分子,为后续研究斑马鱼Gfi1.1基因的功能打下基础。方法:应用RT-PCR从斑马鱼组织中扩增出Gfi1.1 cDNA片段,经回收纯化与pGM-T载体连接并转化感受态细菌DH-5α,通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落,小量提取质粒,Nde I限制性内切酶线性化pGM-T-Gfi1.1质粒,运用T7 RNA聚合酶对Gfi1.1基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得约1.2 kb的DNA片段,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM_001020776)一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-Gfi1.1,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。结论:成功克隆斑马鱼Gfi1.1基因并体外转录及加帽pGM-T-Gfi1.1。     

RNA的生物合成与加工(一)

所有细胞的RNA都是按照DNA模板的指令,由RNA聚合酶催化合成的。RNA的生物合成(转录)过程的有些地方与DNA复制相似,如底物是核苷三磷酸,合成方向是5′→3′。但,RNA聚合酶不需要引物,也不具备有校正作用的核酸外切酶活力。DNA模板在RNA合成中是全保留的,而在DNA复制中则是半保留的。原核生物的转录原核生物转录的源料主要是从大肠杆菌取得的。大肠杆菌的所有RNA都是由同一种RNA聚合酶催化合成的。这种酶的分子量为460KDa,全酶的亚基组成为α_2ββ′σ,核心酶为α_2ββ′。σ亚基只在转录的启动中起作用,