中国傣族、景颇族人群中与艾滋病相关的CCR5△32、CCR2b-64I、SDF1-3'A等位基因多态性分布

为了调查HIV-1感染相关的等位基因CCR5△32、CCR2b-64I、SDF1-3'A在我国云南省德宏州傣族景颇族人群中的频率和多态性分布,此课题以101例傣族和113例景颇族人群为研究对象,应用PCR、PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)分析方法进行检测,计算突变基因频率;并对其群体分布、性别分布进行统计学分析.结果表明,中国傣族景颇族人群中未发现CCR5△32等位基因突变;傣族CCR2b-64I、SDF1-3'A基因突变频率分别为0.2130和0.2030,景颇族CCR2b-64I和SDF1-3'A基因突变频率分别为0.1637和0.1770;与中国汉族人群相比较,傣族和景颇族中SDF1-3'A突变频率较低(P值分别为0.0322和0.0021);两个民族的CCR2b-64I和SDF1-3'A等位基因群体分布符合Hardy-Weinberg平衡,在性别之间分布无显著差异.中国傣族景颇族人群的CCR2b-64I等位基因的突变频率与汉族人相似,SDF1-3'A等位基因的突变频率比汉族人低,此两种突变基因在艾滋病发病过程中的影响值得进一步研究.由于未发现CCR5△32基因突变,中国傣族景颇族人群对HIV-1感染可能有较大的遗传易感性.     

性病艾滋病感染者HIV-1相关基因CCR5Δ32、CCR2b-64I、SDF1-3＇A多态性分布的研究

研究HIV-1相关等位基因CCR5Δ32、CCR26—64I、SDFl-3'A在性病艾滋病感染人群中的突变频率和多态性分布的特点,为我国艾滋病的预防和未来的基因治疗提供初步依据。收集198例汉族性病艾滋病感染的血液标本,提取基因组DNA,经PCR检测,并用统计学方法分析。198例性病艾滋病人群CCR5Δ32、CCR2b-64I、SDFl-3’A的突变频率分别为0．25％、16．16％、25．00％,与中国普通汉族人的结果一致。CCR5Δ32的突变频率较低,而CCR2b-64I、SDFl-3'4的突变频率较高,提示本地性病艾滋病汉族人群对性传播的HIV—1(R-5)毒株有较大的易感性。     

中国傣族、景颇族人群中与艾滋病相关的CCR5△32、CCR2b-64I、SDF1-3′A等位基因多态性分布

为了调查HIV-1感染相关的等位基因CCR5△32、CCR2b-64I、SDF1-3′A在我国云南省德宏州傣族景颇族人群中的频率和多态性分布,此课题以101例傣族和113例景颇族人群为研究对象,应用PCR、PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)分析方法进行检测,计算突变基因频率;并对其群体分布、性别分布进行统计学分析。结果表明,中国傣族景颇族人群中未发现CCR5△32等位基因突变;傣族CCR2b-64I、SDF1-3′A基因突变频率分别为0.2130和0.2030,景颇族CCR2b-64I和SDF1-3′A基因突变频率分别为0.1637和0.1770;与中国汉族人群相比较,傣族和景颇族中SDF1-3′A突变频率较低（P值分别为0.0322和0.0021）;两个民族的CCR2b-64I和SDF1-3′A等位基因群体分布符合Hardy-Weinberg平衡,在性别之间分布无显著差异。中国傣族景颇族人群的CCR2b-64I等位基因的突变频率与汉族人相似,SDF1-3′A等位基因的突变频率比汉族人低,此两种突变基因在艾滋病发病过程中的影响值得进一步研究。由于未发现CCR5△32基因突变,中国傣族景颇族人群对HIV-1感染可能有较大的遗传易感性。 Abstract:The purpose of the work is to investigate the frequencies and polymorphisms of HIV-1 resistant CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Chinese Dai and Chingpaw populations.Whole blood samples from 101 Dai subjects and 113 Chingpaw were collected randomly and their genomic DNA were extracted with QIAgen Blood Kits.Allelic frequencies were identified by PCR-RFLP analysis.Allelic polymorphisms in Dai population or Chingpaw population and both sexes in the samples were analyzed by χ2 test.The frequencies of CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Dai population were 0.0000,0.2130,0.2030,respectively;The frequencies of CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Chingpaw population were 0.000,0.1637,0.1770,respectively.Distributions of the CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles among the both populations were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium.No statistical difference was found in the allelic frequencies of both CCR2b-64I and SDF1-3′A between male and female individuals.The frequencies of CCR5delta32,CCR2b-64I alleles in Chinese Dai and Chingpaw populations are similar to that in Chinese Han population,while the frequency of SDF1-3′A allele in Chinese Dai and Chingpaw populations are lower in contrast to that in Chinese Han population.The genotyping and polymorphism of CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Chinese Dai and Chingpaw populations of Yunnan Province are the first time studied in China.The significance of the three mutant alleles conferring genetic resistance to HIV-1 and AIDS progression remains to be clarified.     

中国傣族、景颇族人群中与艾滋病相关的CCR5△32、CCR2b-64I、SDF1-3′A等位基因多态性分布

为了调查HIV-1感染相关的等位基因CCR5△32、CCR2b-64I、SDF1-3′A在我国云南省德宏州傣族景颇族人群中的频率和多态性分布,此课题以101例傣族和113例景颇族人群为研究对象,应用PCR、PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)分析方法进行检测,计算突变基因频率;并对其群体分布、性别分布进行统计学分析。结果表明,中国傣族景颇族人群中未发现CCR5△32等位基因突变;傣族CCR2b-64I、SDF1-3′A基因突变频率分别为0.2130和0.2030,景颇族CCR2b-64I和SDF1-3′A基因突变频率分别为0.1637和0.1770;与中国汉族人群相比较,傣族和景颇族中SDF1-3′A突变频率较低（P值分别为0.0322和0.0021）;两个民族的CCR2b-64I和SDF1-3′A等位基因群体分布符合Hardy-Weinberg平衡,在性别之间分布无显著差异。中国傣族景颇族人群的CCR2b-64I等位基因的突变频率与汉族人相似,SDF1-3′A等位基因的突变频率比汉族人低,此两种突变基因在艾滋病发病过程中的影响值得进一步研究。由于未发现CCR5△32基因突变,中国傣族景颇族人群对HIV-1感染可能有较大的遗传易感性。 Abstract:The purpose of the work is to investigate the frequencies and polymorphisms of HIV-1 resistant CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Chinese Dai and Chingpaw populations.Whole blood samples from 101 Dai subjects and 113 Chingpaw were collected randomly and their genomic DNA were extracted with QIAgen Blood Kits.Allelic frequencies were identified by PCR-RFLP analysis.Allelic polymorphisms in Dai population or Chingpaw population and both sexes in the samples were analyzed by χ2 test.The frequencies of CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Dai population were 0.0000,0.2130,0.2030,respectively;The frequencies of CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Chingpaw population were 0.000,0.1637,0.1770,respectively.Distributions of the CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles among the both populations were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium.No statistical difference was found in the allelic frequencies of both CCR2b-64I and SDF1-3′A between male and female individuals.The frequencies of CCR5delta32,CCR2b-64I alleles in Chinese Dai and Chingpaw populations are similar to that in Chinese Han population,while the frequency of SDF1-3′A allele in Chinese Dai and Chingpaw populations are lower in contrast to that in Chinese Han population.The genotyping and polymorphism of CCR5delta32,CCR2b-64I,SDF1-3′A alleles in Chinese Dai and Chingpaw populations of Yunnan Province are the first time studied in China.The significance of the three mutant alleles conferring genetic resistance to HIV-1 and AIDS progression remains to be clarified.     

Provincial distribution of three HIV-1 resistant polymorphisms (CCR5-Δ32, CCR2-64I, and SDF1-3'''' A) in China

CCR5-Δ2, CCR2-641, mutants in two chemokine receptors and SDF1-3' A, mutant in a ligand gene, can delay AIDS pathogenesis. The distribution of the three polymorphic loci was studied in 1 046 DNA samples from 26 provinces (cities) in China. No CCR5-Δ32 was observed. CCR2-64I and SDF1-3' A had reverse distribution cline from south to north in China, with average frequency of 20.8% and 24.8% respectively. Relative hazard was evaluated. Important information to the epidemiology of AIDS and the origin and spread of these polymorphic loci in Chinese was provided.     

3个与艾滋病病程相关的基因的多态位点在中国不同地区人群中的分布研究

趋化因子受体基因CCR5 -Δ32 ,CCR2 -6 4I及配体基因SDF1- 3′A突变可推迟艾滋病的病程 .以 1 0 46份来自中国 2 6个省市的DNA样本为对象研究上述 3种多态位点在中国不同地区人群中的分布 ,发现在所观察的群体中没有CCR5- Δ32存在 ,CCR2 -6 4I的基因频度为 2 0 8% ,SDF1 -3′A的基因频度为 2 4 8% ,后两者在中国人群中出现相反的梯度分布 ,并进行了进一步的艾滋病相对风险 (relativehazard ,RH)估计 .对中国人艾滋病流行病学研究及了解这些基因多态位点在中国人群中的起源及扩散提供了重要信息     

基于修饰CCR5基因的艾滋病基因治疗进展

艾滋病药物治疗主要障碍是难以彻底清除病毒、副作用大、成本高且需长期用药。CCR5是HIV侵染的主要辅助受体,缺陷型CCR5(CCR5△32)的CD4+T细胞对R5嗜性HIV-1病毒感染有高度抵抗力。通过骨髓移植CCR5△32干细胞到患者体内可以降低HIV病毒载量至无法检出水平,同时可维持T细胞数目在正常范围内。但由于CCR5△32基因缺失的人群所占比例少、配型困难等问题,CCR5△32干细胞移植无法广泛用于艾滋病的临床治疗。通过锌指核酸酶(ZFNs)或类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)两种方法可以将自体细胞CCR5基因人为部分缺失,将产生的CCR5缺陷细胞回输体内可阻断HIV-1入侵途径,稳定CD4细胞群体并最终清除病毒。而脐带血干细胞具有对配型要求低等优点,使其作为修饰的靶细胞具有广阔的应用前景。     

TALENs介导的CCR5△32/△32突变赋予CD4+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力

CCR5Δ32/Δ32(C C chemokine receptor type 5,CCR5)基因型的骨髓干细胞移植,可以治愈感染人免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的患者。本研究运用TALENs结合同源重组技术产生纯合子的CCR5△32/△32突变,并赋予CD4+ U87 细胞抵抗HIV-1感染的能力。首先,采用重叠延伸PCR合成 CCR5△32 donor DNA。构建CCR5-TALENs 和CCR5△1-TALENs质粒,将CCR5-TALENs 及CCR5△1-TALENs质粒分别结合CCR5△32 donor DNA,共转染野生型CD4+ U87 细胞。其次,用T7E1酶切分析转染后的TALENs和CCR5△1-TALENs打靶效率。通过单克隆培养筛选CCR5△32/△32突变的单克隆细胞。最后,将CCR5△32/△32 CD4+ U87 细胞和野生型CD4+ U87细胞进行Bal HIV-1病毒攻击实验,采用ELISA方法检测上清中P24抗原含量。测序结果表明,通过重叠延伸PCR成功获得1 602 bp CCR5△32 donor DNA;CCR5-TALENs 质粒第1轮、第2轮和第3轮转染,打靶效率分别为14.80%, 38.20%和50.40%;从29个单个细胞培养的克隆中成功筛选出1个CCR5△32/△1基因型CD4+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率为1.7%; CCR5△1-TALEN质粒第2轮转染,打靶效率为23.5%,从34个单细胞培养的克隆中筛选出3个CCR5△32/△32 基因型CD4+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率达到8.8%。Bal HIV-1攻击实验表明,野生型CD4+ U87细胞培养上清第2、4、6、8、10、12 d,平均P24抗原含量分别为58.47±2.35、162.23±4.78、458.78±27.34、613.35±26.78、580.35±24.73、483.34±30.85 pg/mL。而CCR5△32/△32基因型CD4+ U87细胞的培养上清平均P24抗原含量分别为11.30±1.76、5.13±0.88、3.43±0.44、3.84±0.69、3.21±0.44、4.24±0.46 pg/mL。本研究表明,TALENs 结合同源重组技术无缝隙地介导了CCR5△32/△32突变,并赋予了CD4+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力。     

细胞内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1感染抑制作用的研究

人CCR5Delta32突变个体能有效抵制HIV-1感染,主要是由于该个体淋巴细胞内表达的CCR5Delta32突变蛋白能通过反式显性失活效应(TDN)抑制细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的产生．通过构建CCR5Delta32慢病毒载体,体外转染人外周血单个核细胞(PBMCs),研究细胞内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1感染的抑制作用．结果表明,表达CCR5Delta32蛋白的人PBMCs对HIV-1 R5、X4及R5X4毒株感染均具有显著的抑制作用．这些工作为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础．     

CCR2-64Ⅰ在中国南方14个少数民族群体中的分布

为调查HIV-1感染相关等位基因CCR2-64Ⅰ在我国南方14个少数民族群体的频率和多态性分布, 从上述人群外周血中抽提基因组DNA, 采用PCR和PCR-RFLP等方法进行基因分型。在791例调查对象中, 636例是野生纯合子基因型, 104例为杂合子基因型, 51例为突变纯合子基因型。上述各群体等位基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡。14个民族群体的平均突变基因频率为13.6％, 等位基因频率范围分布在1.6％~30.3％之间, 14个民族群体之间突变基因频率具有显著差异(P<0.05)。广西壮族群体CCR2-64Ⅰ突变基因频率最低, 为1.6％, 云南的六库傈僳族频率最高, 为30.3％。12个群体的突变基因频率均低于中国汉族健康群体, 南方3个少数民族群体基因突变频率显著低于西南11个少数民族群体, 该突变基因在艾滋病发病过程中的影响值得进一步深入研究。     

中国4个少数民族中SDF1多态性研究

研究与HIV 1感染相关的基质细胞衍生因子 (SDF1)等位基因突变频率和多态性在中国 4个少数民族的分布特征。应用PCR/ RFLP等方法检测回族 (5 7例 )、鄂伦春族 (71例 )、蒙古族 (30例 )及锡伯族 (2 6例 )共 184个个体中SDF1 -3’A基因突变频率。结果得出中国 4个民族中SDF1- 3’A基因的基因频率分别为 :蒙古族为 38 3%,锡伯族为 2 3 .1%,回族为 2 0 .2 %,鄂伦春族为 10 .6 %。中国 4个少数民族中SDF1- 3’A等位基因频率存在较大的差异 (χ2 =37 .82 6 ,P<0.01) , 提示这 4 个民族的遗传结构存在着一定的差异。 本研究 为评估中国不同民族对 HIV-1 的易感性及艾滋病的流行病学研究提供了基本数据。     

趋化因子受体 CCR5 亲合短肽的筛选

趋化因子受体 5 (CCR5) 是 HIV-1 与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被 CCR5 拮抗剂封闭则会阻止 HIV-1 感染细胞 . 为得到与 CCR5 特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达 CCR5 的 CHO 细胞 (CHO/CCR5) 作为靶标,通过噬菌体随机 12 肽库筛选与 CCR5 特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选 20 个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到 11 个含有 AFDWTFVPSLIL 序列的小分子肽 . 含该序列的噬菌体能与抗人 CCR5 单抗 (2D7) 竞争性结合 CCR5 ,且合成肽 AFDWTFVPSLIL 对趋化因子 RANTES 与 CHO/CCR5 的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与 CCR5 具有特异性结合作用 .     

基于调控趋化性细胞因子受体CCR5抗HIV-1的研究进展

获得性免疫缺陷综合征(AIDS),又称"艾滋病",是威胁着人类生命健康的重大传染性疾病。趋化性细胞因子受体5(Chemotactic cytokine receptor 5,CCR5)作为嗜巨噬细胞性1型人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)进入宿主细胞的必需的辅助受体自发现以来被广泛关注。CCR5在HIV靶细胞表面的表达水平与靶细胞的病毒载量呈正相关且和艾滋病的进程强相关。因此,通过干预CCR5在靶细胞表面的表达能在一定程度上阻止HIV进入靶细胞。因此,本文从分子水平阐述干预CCR5的主要生物学机制,并对近几年的研究进行综述。     

CCR5及其拮抗剂的研究进展

趋化因子CCR5,作为G蛋白偶联因子超家族(GPCR)成员的细胞膜蛋白,是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注,主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等四类。这些抗病毒活性强、高亲和力的CCR5拮抗剂,已有一部分进入了临床试验阶段。本文对近年来CCR5拮抗剂的相关研究进展进行综述。     

人RANTES基因克隆及其体外表达

1995年,Cocchi等[1]发现RANTES、MIP-1α和MIP-1β等β-趋化因子具有抗HIV-1感染活性.1997年,Feng等[2]和Deng等[3]证实β-趋化因子受体CXCR4和CCR5分别是HIV-1侵染T淋巴细胞和巨噬细胞的辅助受体(co-receptor).T淋巴细胞嗜性(T-tropism)分离株被称为X4毒株,巨噬细胞嗜性(M-tropism)分离株则被称为R5毒株[4].RANTES与CCR5有着高度的亲和力,二者的结合可对HIV-1的细胞附着产生空间位阻效应,并下调CCR5在细胞表面的表达.这一结果使RANTES抗HIV-1感染机制在分子水平上得到合理的解释.最近,Garzino-Demo等[5]证明,β-趋化因子的诱导分泌与HIV-1感染后疾病进程的控制有着密切的关系,而且人群中β-趋化因子水平存在着显著的个体差异,表明β-趋化因子对艾滋病具有潜在的预防和治疗价值.为此,我们在克隆人RAN-TES基因的基础上,在体外转录与翻译系统中实现了该基因的表达,有利于今后进一步开展艾滋病的基因治疗.     

中国人艾滋病毒感染者及健康人群人类免疫缺陷病毒CCR5开放阅读框架区天然突变的对比研究

目的 研究中国人群CCR5基因开放阅读框架(ORF)区突变并分析其对中国人人类免疫缺陷病毒(HIV)传播和致病的影响。方法 研究对象为居住在香港特区的1099名成年中国人,其中785名为HIV阴性健康人,314例为确诊HIV感染的患者。首先对CCR5 ORF进行测序,确定并分析CCR5突变在人群的分布。再对突变G106R、Δ32、R223Q、299(FS)和S3361体外克隆,研究其表达及作为HIV辅助受体功能的改变。结果 在CCR5 ORF共检测到10个突变位点。其中7个为有意义突变;突变R223Q是发生频率最高的突变,在正常人是4．7％,在HIV感染者是4．5％;其余CCR5 ORF突变发生频率均＜1％; R223Q位于CCR5膜内区,不影响其作为HIV辅助受体的功能;S336I位于CCR5的C端,同样不影响其功能;突变G106R位于CCR5第3跨膜区,实验显示其辅助受体功能受到明显影响。结论 CCR5 ORF突变在中国人群较为常见,一些突变明显影响其作为HIV辅助受体的功能,但在流行病学范围内对HIV感染及致病的影响不明显。     

RANTES衍生物与HIV-1进入抑制剂

HIV-1-1进入抑制剂的研究是近年来艾滋病药物研发领域的新热点,其中最受关注的是以CCR5为靶点的新药研发。CCR5是病毒进入细胞的主要辅助受体,在HIV-1进入宿主细胞过程中起着非常重要的作用。作为CCR5的天然配体,CC类的趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β都是极具潜力的HIV-1抑制剂,特别是有关对RANTES的定向设计的研究尤为引人关注,其目的是设计出一种既有很强的抗病毒能力而又不引发炎症反应的HIV-1拮抗剂。就RANTES衍生物应用于抑制HIV进入细胞方面的研究进行了综述。     

CCR2介导MCP-1诱导的人内皮细胞凋亡

本室前期工作发现,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)可诱导人内皮细胞(hVECs)凋亡.为进一步揭示MCP-1诱导凋亡分子机理,首先观察MCP-1对hVECs CC类趋化因子受体2(C-C motifchemokine receptor-2,CCR2)蛋白表达的影响.Western印迹结果显示,MCP-1以剂量依赖方式诱导CCR2在hVECs的表达.以脂质体为载体的CCR2反义寡核苷酸序列转染hVECs后,激光共聚焦显微镜及膜联蛋白(annexin)V-FITC/PI双染流式细胞术显示,CCR2反义寡核苷酸转染hVECs48h后可明显降低CCR2蛋白质的表达(P0.05),抑制MCP-1诱导的hVECs凋亡(P0.01).反义CCR2抑制凋亡结果与加入CCR2阻断剂RS102895后细胞凋亡测定结果一致.上述结果表明,MCP-1的主要受体CCR2介导了MCP-1诱导的hVECs凋亡.