小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较

目的克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析。方法应用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析。结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88（GenBank登录号：EF625347）的编码区,获得大小为1965bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员（CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22）进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39～491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构。结论在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似。     

牧草盲蝽CYP6A13和钠离子通道LPVSSC基因的克隆及参与高效氯氟氰菊酯的抗性分析

昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性主要是解毒酶活性的增强和钠离子通道的敏感度降低所致。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了牧草盲蝽Lygus pratensis P450 CYP6A13基因（GenBank登录号：MN782520）及钠离子通道LPVSSC基因cDNA全长序列（GenBank登录号：MW821485）。其中CYP6A13基因全长2 003 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子质量为57.2 kDa,主要位于细胞内质网,等电点为5.77,无跨膜区和信号肽,存在血红素结合保守功能区。同源比对与系统进化分析表明,牧草盲蝽的CYP6A13与分类学关系上较为接近的昆虫同源蛋白间高度相似。钠离子通道序列LPVSSC开放阅读框6 072 bp,编码2 024个氨基酸,预测蛋白分子质量为228.94 kDa,等电点为4.99,无信号肽,有多个跨膜区域,4个同源结构域（I~IV）,每个结构域有6个跨膜片段（S1~S6）,存在MFM基序。基因表达谱结果表明：CYP6A13在牧草盲蝽成虫头部的表达量高于胸、腹部;室内筛选的高效氯氟氰菊酯抗性R14、R6品系的CYP6A13表达量是敏感品系的18.74和5.45倍;CYP6A13表达量在雌、雄成虫之间无显著差异;不同发育期基因表达量为：初羽化成虫>5龄若虫>4龄若虫>3龄若虫>2龄若虫>1龄若虫。测序比对高效氯氟氰菊酯抗性与敏感品系的钠离子通道序列IIS4~IIS6区域,未发现存在可能导致靶标抗性的氨基酸突变。结果表明CYP6A13基因过表达可能导致了牧草盲蝽对高效氯氟氰菊酯的抗药性,为深入解析CYP6A13基因介导抗药性的功能研究奠定基础。     

亚致死浓度溴虫腈和毒死蜱对等钳蠊螨生长繁殖和解毒酶的影响

【目的】害虫综合治理中,化学防治对天敌资源也具有一定的杀伤力。为缓解这一矛盾,本研究旨在探究溴虫腈和毒死蜱亚致死浓度处理对等钳蠊螨Blattisocius dentriticus生长繁殖及解毒酶活性和基因表达量的影响。【方法】利用药膜法处理2-3日龄等钳蠊螨成螨24 h,测定溴虫腈和毒死蜱的亚致死剂量;测定和比较LC_(10)和LC_(30)剂量这两种药剂处理后F_0和F_1代的产卵量、产卵期、卵孵化率和雌成螨寿命等生物学特性的变化;通过酶活力分析和RT-PCR分别测定LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量下这两种药剂处理后钳蠊螨成螨体内谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)、细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)酶活力及其基因表达量变化。【结果】溴虫腈和毒死蜱处理24 h对等钳蠊螨成螨的LC_(50)分别为42.56 mg/L和72.42 mg/L。溴虫腈和毒死蜱LC_(10)和LC_(30)剂量处理等钳蠊螨雌成螨后,与对照(清水处理)相比,仅F_0代雌成螨寿命和产卵期显著缩短(P0.05),而产卵量和卵孵化率无明变化。酶活力测定结果发现,GST, CYP450和CarE的活力在溴虫腈和毒死蜱LC_(10)和LC_(30)剂量处理后无明显变化,而LC_(50)剂量下,上述3种酶的活力均显著增加(P0.05)。基因表达结果表明,溴虫腈LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量处理下2个GST基因(BdGST3和BdGST6)、3个CYP450基因(BdCYP2-4)和5个CarE基因(BdCarE1-5)表达均显著上调;在毒死蜱这3个剂量处理下3个GST基因(BdGST1,BdGST3和BdGST4)、3个CYP450基因(BdCYP2,BdCYP5和BdCYP6)和2个CarE基因(BdCarE1和BdCarE2)表达量均显著上调。【结论】结果表明,LC_(10)和LC_(30)剂量的溴虫腈和毒死蜱亚致死剂量会抑制F_0代雌成螨的生长繁殖;LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量下这两种药剂可诱导等钳蠊螨GST, CarE和CYP450基因表达;LC_(50)剂量能明显诱导等钳蠊螨体内GST, CarE和CYP450活性上升。该研究为等钳蠊螨抗性品系的筛选及田间应用提供了理论依据。     

变态幼蛙对蝌蚪时期农药胁迫的毒性响应

本研究探讨阿特拉津和毒死蜱染毒东北林蛙蝌蚪对变态幼蛙肝脏组织抗氧化酶、解毒酶、细胞色素P450 3A(CYP3A)mRNA的影响.实验通过二者梯度剂量,单独、共同胁迫蝌蚪,变态完成后分析了肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CbE)及CYP3A mRNA表达的响...     

CYP3A4基础与临床研究进展

细胞色素P4503A4(CYP3A4)是存在人类肝脏及肠道中的一种主要的细胞色素CYP450酶,约占成人肝脏CYP450酶总量的25%左右。临床中约有50%的药物是通过其代谢,并且其基因位点突变也与其多种疾病相关,知晓CYP3A4的表达水平和不同功能的遗传学基础,无论是对疾病的发病基础、临床药物的应用,会带来前所未有的启发,在药物应用过程中,通过对基因组学的认识,从而可以在基因层面了解个体代谢差异产生的原因,调整药物用量,提高疗效,最终使药物副作用降到最低限。目前对CYP3A4的研究渐趋于成熟,已逐渐阐明了其药物间相互作用的机制,它能够被多种药物竞争性抑制或者诱导,并受到某些蛋白受体的调控影响,可改变药物的药代动力学,增强或降低药效,造成个体用药差异,这也是造成药物间相互作用的重要原因。然而CYP3A4基因多态性与基因导向治疗关系,还有待进一步深入研究。该文对CYP3A4基因多态性、分布以及与临床疾病及用药的研究现状作一综述。     

实验用西藏小型猪CYP3A基因的克隆及序列分析

目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。     

亚致死剂量毒死蜱对飞蝗细胞色素P450酶活性及基因表达的影响

【目的】研究有机磷杀虫剂毒死蜱对飞蝗体内细胞色素P450的影响。【方法】采用酶活力测定法和实时定量PCR技术分别研究了毒死蜱3种亚致死剂量(LD_(10)、LD_(30)和LD_(50))处理飞蝗3龄幼虫24 h后,体内细胞色素P450酶活性及CYP409A1和CYP408B1基因表达量的变化。【结果】不同亚致死剂量毒死蜱处理引起细胞色素P450活性显著性降低,分别为对照组的0.68、0.50和0.62倍。同时通过mRNA水平表达的差异比较显示,飞蝗的两个P450基因CYP409A1和CYP408B1的表达受到抑制,均出现表达量减少的现象。【结论】某些细胞色素P450基因表达受不同亚致死剂量毒死蜱的抑制而使酶的量被降低,从而造成飞蝗整体细胞色素P450酶活性的下降。     

西兰花CYP83A1基因的克隆及序列分析

为深入研究西兰花4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷的合成代谢途径,对关键合成酶基因CYP83A1进行了克隆与生物信息学分析。根据前期西兰花转录组测序工作中获得的序列数据,同时参照Gen Bank数据库中拟南芥、小白菜和油菜等7种植物的CYP83A1基因CDS序列与西兰花进行比对,确定西兰花CYP83A1基因(Bo CYP83A1)的CDS序列。采用RT-PCR技术对其进行了克隆,获得Bo CYP83A1基因的CDS区序列,其全长为1 509 bp,编码502个氨基酸。预测该蛋白质的分子量为57.47 k D,理论等电点为7.1,包含2个跨膜结构域,且整个序列中不含信号肽,具有一个典型的P450结构域。氨基酸同源性分析表明,西兰花与油菜、大白菜的CYP83A1的相似性较高,均为98%。首次获得Bo CYP83A1的CDS序列,其登录号为KM111290。     

CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响

CYP7A1（cholesterol 7α-hydroxylase ）在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达, 利用荧光素酶作为报告基因,将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3 basic质粒载体中,再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明,2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列,含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示,当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示,CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达,其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.     

甜菊醇糖苷生物合成途径关键酶基因KA13H的克隆及序列分析

本研究利用RT-PCR方法从甜叶菊叶片中分离了一个与甜菊醇糖苷生物合成密切相关的基因KA13H,对该基因的ORF、编码产物结构、同源性比对及次级结构等进行了生物信息学预测分析,同时初步分析该基因的组织表达和原核表达。经DNAMAN6.0软件分析,该基因编码一条分子量为54.476kD的由476个氨基酸残基组成的多肽,含有典型的细胞色素P450的血红素结合位点FXXGXXXCXG,TMPRED程序预测其C-端含有一个明显的跨膜区MIQVLTPILLFLIFFVFWKVY,是一个典型的细胞色素P450基因。推断的KA13H编码产物与其它生物合成相关细胞色素P450同源比对和系统发生分析表明,该蛋白与苜蓿(Medicago truncatula)CYP716A12和云杉(Sitka spruce)CYP720B1的一致性较高,分别为51%和46%,推测KA13H可能与CYP716A12和CYP720B1具有类似的功能。KA13H次级结构分析结果表明,KA13H与CYP74A2的一致性仅为15%,但是它们却有着类似的次级结构,都含有6个基质识别位点(SRSs)。半定量RT-PCR分析表明:KA13H在根、茎、叶和花中呈组成型表达,叶和花中的表达丰度较高;将该基因融合到原核表达载体pGEX-4T-1中,在原核中得到了成功表达。根据本研究结果,我们推测KA13H可能在甜菊醇糖苷生物合成过程中发挥着重要作用,该基因的克隆和表达分析为进一步深入了解甜菊醇的生物合成过程中相关酶和基因的功能奠定了基础。     

Inhibition of CYP450 1A and 3A by berberine in crucian carp Carassius auratus gibelio

Berberine has long been considered as an antibiotic candidate in aquaculture. However, studies regarding its effects on drug-metabolizing enzymes in fish are still limited. In the present study, the effects of berberine on cytochrome P4501A (CYP1A) and CYP3A in crucian carp were investigated. Injection of different concentrations of berberine (0, 5, 25, 50, and 100 mg/kg) inhibited the CYP1A mRNA expression, thereby inhibiting further the catalytic activity of CYP1A-related ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD). Furthermore, both CYP1A expression and EROD activity were further inhibited with increasing berberine concentrations. In addition, the CYP3A expressions at both the mRNA and the protein levels were downregulated by higher berberine concentrations. The catalytic activity of CYP3A-related erythromycin N-demethylase (ERND) was also inhibited by berberine at a dose of no less than 25 mg/kg. Moreover, at the berberine concentration exceeding 25 mg/kg, the inhibition of CYP3A expression and ERND activity increased with increasing berberine concentrations. In vitro experiments were also performed. When berberine was pre-incubated with the crucian carp liver microsomes, it competitively inhibited the corresponding EROD activity with the IC₅₀ of 11.7 μM. However, the ERND activity was slightly inhibited by berberine with the IC₅₀ of 206.4 μM. These results suggest that, in crucian carp, berberine may be a potent inhibitor to CYP1A, whereas the CYP3A inhibition needs a higher concentration of berberine.     

放养鲢鱼(Hypophthalmichys molitrix C et V)对水库围隔浮游生物群落的影响

本文研究在水库围隔实验生态系统中鲢鱼对浮游生物群落的影响。结果表明,放养鲢鱼后,浮游动物生物量、浮游植物生物量、叶绿素a和浮游植物毛产量分别下降了58.7％、63.6％、52.5％和65.0％;透明度、浮游植物群落多样性指数分别提高了18.2％、32.5％;铜绿微囊藻数量减少了90.6％“水华”得到明显抑制。但小型绿藻(<20μm)数量未出现显著变化,因而其在藻类生物量中所占比例反而提高了82.3％。围隔内可被鲢鱼滤食的大型藻类(硅藻、甲藻、隐藻和绿藻(>20μm))占藻类生物量的85.8％,因此鲢鱼的存在能明显限制浮游植物的生物量。此外,放养鲢鱼还显著降低了水体中的COD,TP,DO和pH值,这表明鲢鱼对水质有净化作用。     

A chronic high-cholesterol diet paradoxically suppresses hepatic CYP7A1 expression in FVB/NJ mice

Cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) encodes for the rate-limiting step in the conversion of cholesterol to bile acids in the liver. In response to acute cholesterol feeding, mice upregulate CYP7A1 via stimulation of the liver X receptor (LXR) α. However, the effect of a chronic high-cholesterol diet on hepatic CYP7A1 expression in mice is unknown. We demonstrate that chronic cholesterol feeding (0.2% or 1.25% w/w cholesterol for 12 weeks) in FVB/NJ mice results in a >60% suppression of hepatic CYP7A1 expression associated with a >2-fold increase in hepatic cholesterol content. In contrast, acute cholesterol feeding induces a >3-fold upregulation of hepatic CYP7A1 expression. We show that chronic, but not acute, cholesterol feeding increases the expression of hepatic inflammatory cytokines, tumor necrosis factor (TNF)α, and interleukin (IL)-1β, which are known to suppress hepatic CYP7A1 expression. Chronic cholesterol feeding also results in activation of the mitogen activated protein (MAP) kinases, c-Jun N-terminal kinase (JNK) and extracellular signal-regulated kinase (ERK). Furthermore, we demonstrate in vitro that suppression of CYP7A1 by TNFα and IL-1β is dependent on JNK and ERK signaling. We conclude that chronic high-cholesterol feeding suppresses CYP7A1 expression in mice. We propose that chronic cholesterol feeding induces inflammatory cytokine activation and liver damage, which leads to suppression of CYP7A1 via activation of JNK and ERK signaling pathways.     

Effects of mammalian CYP3A inducers on CYP3A-related enzyme activities in grass carp (Ctenopharyngodon idellus): Possible implications for the establishment of a fish CYP3A induction model

Unexpected drug-drug interactions in fish are generally associated with the induction of CYP3A activity and may lead to the formation of drug residues and thus threaten the safety of fishery products. However, little information is available about CYP3A induction in fish. In the present study, we determined the in vivo and in vitro effects of typical mammalian CYP3A inducers (rifampicin, phenobarbital and dexamethasone) on CYP3A-related enzyme activities in a freshwater teleost, the grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Our results showed that the response to rifampicin was similar for grass carp liver cell line (GCL), liver microsomes and the primary hepatocytes of grass carp, as indicated by the activity of aminopyrine N-demethylase (APND). When erythromycin N-demethylase (ERND) and 6beta-testosterone hydroxylase (6beta-TOH) were taken into consideration, the GCL displayed a greater capacity for conducting CYP3A metabolism and induction than the C. idellus kidney cell line (CIK). Using erythromycin and testosterone as substrates, we demonstrated that CYP3A catalysis exhibited non-Michaelis-Menten kinetics in GCL cells, and that V(max)/K(m) values were significantly increased due to rifampicin-treatment. Overall, this study may have implications for the use of GCL as a CYP3A induction model to identify physiological changes in fish as well as the similarities or differences between fish and mammals.     

基于MATLAB轨迹跟踪研究重金属铜对鲢幼鱼自发游泳行为的影响

鱼类行为的改变可以作为识别突发环境污染的一项敏感指标。为了量化鱼类对重金属污染的行为响应, 通过视频记录及MATLAB软件定量分析了不同浓度急性铜暴露(0、1、2、3、4 mg/L)对幼鱼的呼吸代谢、运动行为及幼鱼组织中铜离子含量。结果表明: 重金属铜离子存在对鲢幼鱼(Hypophthalmichthys molitrix)的运动时间比和呼吸频率影响显著(P<0.05), 随着铜离子浓度增大, 鲢幼鱼运动时长下降, 当铜离子浓度为4 mg/L时运动时长最小(t=8min), 比对照组减少了72.41%; 鲢幼鱼5min内的平均运动速度、平均加速度和总运动路程随着铜离子浓度增大而逐渐减小, 最小平均速度为29.50 mm/s, 最小平均正加速度大小为45.18 mm/s2, 最小平均负加速度大小为42.64 mm/s2, 加速的能力强于减速能力; 鲢幼鱼各组织中铜含量的顺序为: 肝脏>鳃>肌肉, 但差异不显著。研究结果可为水质预警和快速评价水体的综合毒性提供基础数据和理论基础。     

基于几何形态测量学的磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯对鲢仔鱼形态影响研究

为了解磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)对鲢仔鱼生长抑制性在外部形态上的表现性状,研究基于几何形态测量学方法对0.05、0.5、5和50μg/L共4个浓度组与对照组进行组间形态性状差异比较分析。利用PLYMPLUS系统获取鲢仔鱼样本图像信息并测量体长,利用万分电子天平称量体重,使用TPS系列软件提取坐标点数据,并通过Morpho J软件完成主成分分析、典型变量分析及结果可视化。除0.05μg/L浓度组外,其他浓度组鲢仔鱼的体长、体重均显著低于对照组,表明TDCIPP对鲢仔鱼的生长发育具有抑制效应。主成分分析和典型变量分析结果显示,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)共占总体变量的62.15%(分别为47.64%和14.51%);第一典型变量(CV1)和第二典型变量(CV2)共占总体变量的79.48%(分别为54.55%和24.93%),满足用于鲢仔鱼形态分析的要求。网格轮廓分析结果显示,各浓度组鲢仔鱼平均形态均与对照组间存在显著差异(P<0.05),并且主要表现为头部、躯干纵轴和尾部发育迟缓。