短发夹 RNA 介导 RNA 干扰的时间 和剂量效应研究

用 RNA 干扰 (RNA interference , RNAi) 技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中 RNAi 作用的剂量和时间效应 . 应用 Lipofectamine 2000 将外源报告基因的表达载体与编码短发夹 RNA (short hairpin RNA , shRNA) 的质粒共转染 HEK293H 细胞,观察 shRNA 载体对报告基因的抑制效应 . 转染后, shRNAs 的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达 . 在共转染后 12 , 24 , 48 , 60 , 72 , 96 h 时检测 EGFP (enhanced green fluorescent protein , EGFP) 基因 mRNA 及蛋白质表达水平,结果显示, EGFP mRNA 及蛋白质表达在 12 h 时略有降低, 24~48 h 时表达逐渐降低, 48~72 h 时降低最明显,其后 EGFP 表达水平逐渐恢复 . 提示该过程中 RNAi 效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势 . 共转染一系列剂量比例的 EGFP 干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内, RNA 干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一“平台期” . 此外,通过 RNAi 抑制 HeLa 细胞、 HEK293 细胞中荧光素酶基因的表达, 荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应 . 这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的 RNAi 作用呈现剂量和时间依赖性效应 . 这为基于载体表达的 RNAi 技术应用研究提供了一定的理论参考及依据 .     

CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响

CYP7A1（cholesterol 7α-hydroxylase ）在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达, 利用荧光素酶作为报告基因,将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3 basic质粒载体中,再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明,2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列,含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示,当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示,CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达,其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.