猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

PCR 扩增人型结核杆菌 DNA 及结核杆菌属 DNA 探针的制备

用多聚酶链反应(PCR)方法扩增人型、牛型结核杆菌基因组 DNA,获得特异的158 bpDNA 片段,而从另外十三种分枝杆菌未见到特异的扩增产物.回收158 bpDNA 片段作探针,它除与人型、牛型结核杆菌有特异的杂交信号外,与金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及一些分枝杆菌皆没有杂交反应.结果表明,PCR 可用于检测结核杆菌基因组 DNA,扩增产物158 bp DNA 片段可作为探针用于检测人型、牛型结核杆菌并鉴别结核杆菌与其它分枝杆菌.     

泌尿生殖道沙眼衣原体omp1基因多态性研究

从中国不同城市收集疑为沙眼衣原体(Ct)感染的泌尿生殖道标本323份,巢式PCR扩增Ctomp1基因片段(包括4个变异区),测定其中96份阳性标本omp1基因序列,根据同源性分型并分析其多态位点;根据氨基酸序列,用Mega 3软件构建进化树,分析临床株与相应参考株之间的亲缘关系。从96份沙眼衣原体阳性标本中,检出28种基因变体,其中E型最常见;同时发现Ct E、F型omp1基因高度保守,而其它基因型都显示一定的变异性。进化树分析发现,各临床株与相应参考株之间遗传距离较近。实验结果表明沙眼衣原体omp1基因呈现较大的多态性,可为其疫苗的研制及感染的防治提供重要的实验依据。     

新型MGB探针在沙眼衣原体实时PCR检测中的应用

为建立基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法,探讨其临床应用价值,用 PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464～2 980 nt段,并克隆入pMD18-T载体用作参比模板,设计一对引物和一个TaqMan-MGB探针,优化反应条件,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,并运用该系统同时应用连接酶链式反应(LCR)法对临床标本进行检测.结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,最低检测限度为1 DNA拷贝每反应;在10⁰～10⁹ DNA拷贝每反应范围内,C_t值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）和DNA拷贝数呈线性关系（r＞0.990）;对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.以上结果表明,所建立的基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

一种检测转1Dx5基因小麦植株的新方法

目的:建立一种有效区分Glu-1D等位基因的Multiplex-PCR体系,快速检测转1Dx5小麦植株。方法:根据1Dx5和1Dx2亚基基因的区别设计特异的PCR引物,通过多重PCR技术检测花粉管通道法转化1Dx5核心片段的转基因T1代植株。结果:Multiplex-PCR能够在转基因T1代材料中扩增Glu-1D等位基因的特征条带,分别为343bp、320bp的1Dx5基因特异片段以及361bp的1Dx2基因特异片段,与预期结果一致。结论:该技术能够检测多个靶基因,有效地区分转基因Glu-1D上的等位基因,证实外源1Dx5基因已整合到受体基因组中,对检测基因组庞大、外源基因序列GC含量高且与内源基因同源性高的转基因小麦十分有效。     

添加有扩增内标的沙门氏菌荧光定量PCR 检测体系的建立与评价

【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引物法构建扩增内标,优化参数,建立沙门氏菌内标PCR检测体系,利用特异性和灵敏度实验评价体系的检测性能。【结果】筛选得到的新特异靶点基因编码III型分泌系统蛋白(ssaQ)。针对该基因设计特异引物(SsaQ6),建立了添加有扩增内标的常规PCR和EvaGreen荧光定量PCR检测体系;二者对151株沙门氏菌和34株非沙门氏菌的检测符合率均达100%,对基因组DNA的检测下限达14.9拷贝/PCR和2.76拷贝/PCR;人工污染牛奶样品(初始染菌量:4-6 cfu/10 mL),増菌10 h和8 h后分别可检出沙门氏菌。【结论】本研究发掘的新靶点基因ssaQ特异性强,基于这一新靶点建立的添加有扩增内标的EvaGreen荧光定量PCR比常规内标PCR的检测限更低,重复性更好,快速方便,在12 h内即可得出检测结果,并且定量准确,有利于推进沙门氏菌PCR检测方法的标准化应用。     

聚合酶链技术检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体感染的方法与分析

由淋球菌和沙眼衣原体、解脲支原体感染引起的特异性和非特异性尿道炎,临床上缺乏快速准确的诊断方法。近年来发展起来的聚合酶链反应技术,通过对每种病原体特有的DNA 序列进行体外特异扩增,可以快速准确鉴定之。本文用该技术对引起泌尿系统感染的三种病原体进行检测研究,它具有快速、特异、准确等优点,并检测123 例感染者,结果,淋球菌感染占74 % ,沙眼衣原体感染占39 % ,解脲支原体感染占30-9 % 。     

聚合酶链技术检验淋球菌,沙眼衣原休,解脲支原体感染的方法与分析

由淋球菌和沙眼衣原体、解脲支原体感染引起的特异性尿道炎,临床上缺乏快速准确的诊断方法。近年来发展起来的聚合酶链反应技术,通过对每种病原体特有的ＤＮＡ序列进行体外特异扩增,可以快速准确鉴定之。本文用该技术对引起泌尿系统感染的三种病原体进行检测研究,它具有快速、特异、准确等优点,并检测１２３例感染者,结果,淋球菌感染占７４％,沙眼衣原体感染占３９％,解脲支原体感染占３０．９％。     

假定蛋白CT440在沙眼衣原体感染细胞中的定位研究

包涵体膜蛋白在沙眼衣原体致病过程中发挥重要的作用.为确定假定蛋白CT440在沙眼衣原体感染细胞中的定位及特征,本研究采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增Ct440基因,克隆入pGEX-6p原核表达载体构建pGEX-6p/Ct440原核表达重组体,重组体转化到XL1-blue大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白GST-CT440.纯化后的CT440融合蛋白免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光(IFA)和Western blot测定抗体的特异性.特异性抗体用于分析CT440蛋白在衣原体感染细胞内的定位、表达时相特征及其对衣原体感染的影响.结果表明,CT440蛋白定位于沙眼衣原体包涵体膜上,为沙眼衣原体包涵体膜蛋白;该蛋白在衣原体感染12h后开始表达,直至持续到整个感染周期;转基因在胞浆表达的CT440融合蛋白不影响其后的衣原体感染.本实验为深入研究衣原体与宿主细胞间的相互作用,阐明衣原体致病机制提供了重要的实验依据.     

CT358蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的定位及特性分析

确定沙眼衣原体CT358蛋白在衣原体感染细胞中的位置并初步鉴定其生物学功能．采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增CT358基因,并克隆入pGEX和pDSRedC1表达载体中．将重组质粒pGEX-CT358转化到XL1-blue宿主菌,并诱导表达融合蛋白GST-CT358．纯化后的CT358融合蛋白免疫小鼠制备抗体,应用间接免疫荧光技术对CT358蛋白在衣原体感染细胞内的定位及表达模式进行分析．同时,pDSRedC1-CT358重组质粒瞬时转染HeLa细胞,观察CT358蛋白对衣原体感染的影响．实验结果证明CT358蛋白为沙眼衣原体包涵体膜蛋白．该蛋白质在衣原体感染12 h后就表达定位于包涵体膜上,直至持续到整个感染周期,转基因在胞浆表达的CT358融合蛋白不影响其后的衣原体感染．该研究为深入研究衣原体与宿主细胞间相互作用提供了新的线索,并可为衣原体性的治疗、预防提供新方向．     

慢性阴道炎患者生殖道解脲脲原体和沙眼衣原体感染分析

目的通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性阴道炎患者阴道内解脲脲原体(Uu)和沙眼衣原体(Ct)感染状况,用以指导临床正确治疗。方法应用荧光定量聚合酶链反应对380例慢性阴道炎患者的阴道分泌物进行解脲脲原体和沙眼衣原体PCR检测。结果解脲脲原体阳性率为42.9%,其阳性标本的平均拷贝数为3.4×105copies/ml,沙眼衣原体阳性率为16.6%,其阳性标本的平均拷贝数为5.8×104copies/ml,解脲脲原体和沙眼衣原体合并感染的阳性率为12.6%。结论PCR技术具有简便、快捷、准确的优点,是目前快速诊断慢性阴道炎患者Uu、Ct感染状况的可靠诊断方法之一。     

冰冻组织切片RT—PCR法快速检测组织内的mRNA

本文设计了大鼠β-肌动蛋白基因的一对 引物,用冰冻组织切片RT-PCR方法,检测了鼠肝、肾该基因的mRNA,结果能够扩增该基因的cDNA片段和基因组片段。用这种新的方法进行RT-PCR检测组织的mRNA,快速、简单,同时也能够避免组织RNA的降解、污染。该方法也能直接PCR检测基因组的DNA片段。     

西部马脑炎病毒基因组序列的半套式RT-PCR检测

为进一步提高RT－PCR检测西部马脑炎病毒（WEE）病毒基因组方法的敏感性,采用半套式PCR扩增病毒基因组特异序列,首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA,然后以此cDNA为模板,进行扩增。对扩增后电泳检查无可见DNA条带的产物进行半套式PCR;与此同时对扩增的循环数、Mg^ 浓度和退火温度等条件进行了优化,以进一步提高扩增的特异性。结果第一轮PCR未扩出特异笥片段的WEE病毒稀释度,其半套式扩增出特定大小的DNA产物;同时优化的条件提高了扩增产物的特异性。扩增产物约为190bp的单一DNA片段,其大小与预期的相一致,结果表明采用半套式RT－PCR方法检测WEE病毒的基因组序列的敏感性可提高100倍以上。     

应用两种基因组快速扩增方法进行病毒芯片杂交鉴定

为了摸索均衡的病毒基因组扩增方法,建立高通量的病毒检测基因芯片技术平台,本研究以甲病毒属的辛德比斯病毒作为检测模型,分别以随机PCR扩增法和MDA( Multiple Displacement Amplification)扩增法扩增病毒基因组,并以两种扩增产物作为模板,扩增辛德比斯病毒的特异基因片段以验证基因组扩增的均衡性;然后将两种基因组扩增产物标记荧光染料后与基因芯片进行杂交;结果表明从两种基因组扩增产物中正确扩增出了辛德比斯的特定基因片段,作为探针可与基因芯片上的靶标基因特异性结合;基因组扩增产物与基因芯片进行杂交,可成功检测到甲病毒属的特异性信号,充分说明随机PCR扩增法和MDA扩增法用于扩增病毒基因组均具有良好的均衡性,扩增产物可用于病毒性病原体的基因芯片检测。     

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列的细胞种属鉴别及细胞交叉污染分析

目的建立一种快速、简便、敏感和特异的基于线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,CoI)基因序列的细胞基质检测方法,用于细胞种属鉴别和不同种属间的细胞交叉污染分析。方法①提取非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、狗肾细胞(MDCK细胞)和牛肾细胞(MDBK细胞)基因组DNA,以PCR扩增相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因条码序列,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与文献报道的来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守区的基因条码序列片段大小进行对比,以确定细胞的种属类别;②用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与相应细胞和其他不同种属的细胞的基因组DNA进行PCR扩增,检测方法的特异性;用不同浓度的细胞基因组DNA与相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物进行PCR扩增,检测方法的灵敏度;③以不同种属细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与多种细胞混合液提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增,检测细胞间的交叉污染。结果 Vero细胞、MDCK细胞及MDBK细胞线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小,与来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小相符。该方法具备较好的特异性,检测灵敏度为1.0 ng/μL,不同种属间细胞的交叉污染可被检出。结论该方法可有效地判断细胞的种属来源,亦可用于不同种属间细胞交叉污染的分析。     

PCR技术在检测鼠金黄色葡萄球菌中的应用研究

目的　建立实验大小鼠金黄色葡萄球菌的快速检测方法———PCR法。方法　根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果　金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性 ,结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。结论　本研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测。     

转基因水稻BPL9K-2事件特异性检测方法的建立

利用hiTAIL-PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450bp,与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 765位核苷酸残基之后。根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列,设计引物扩增得到485bp的特异片段,通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 825位核苷酸残基之前。因为外源基因插入和非正常重组,水稻基因组上缺失了59个核苷酸。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法,可以分别扩增到片段大小为449bp和485bp的特异条带。该方法特异性好,灵敏度高,能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0. 1%的模板中检测出转基因成分。依据旁侧序列,建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法。这些方法的建立,为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持。     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

多重PCR同时检测人乳头瘤病毒、巨细胞病毒和沙眼衣原体

为了应用聚合酶链反应同时检测人巨细胞病毒（CMV）、人乳头瘤病毒（HPV）、沙眼衣原体（CT）,参照文献报道的基因序列,设计合成了三对能扩增370bp、450bp、510bp基因片段的引物,并对PCR扩增条件进行了优化。0.1fgHPV－DNA、CMV－DNA、CT－DNA即可被检出,得到了与设计片段相同的产物,且不扩增大肠杆菌、白色念球菌、解尿支原体等病原的核酸。对395例标本进行检查,各病原体的检出率分别是：HPV19.2%、CMV14.9%、CT5.1%。其中混合感染42例。PCR同时检测CMV、HPV、CT经济、快速、敏感、特异,可用于临床诊断和实验研究。     

小麦内源特异参照基因的查找与定性PCR和实时荧光PCR验证

目的:先从理论上查找和比对了小麦属(Triticum)γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法从实验特异性上进行了验证。方法:选择小麦基因组中部分基因序列在NCBI中进行同源性分析,查找在小麦中存在的内源特异参照基因,找到小麦属(Triticum)特异的γ-醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成该基因的引物和探针序列,同时用定性PCR和实时荧光PCR方法进行检测,并优化了实验条件。结果:不仅在理论上查找和比对了γ-醇溶蛋白基因为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法进行了实验特异性的验证。定性PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,只在小麦属中可以检测到328bp的目的片段,而在其它作物中未扩增出目的片断。同样实时荧光PCR验证的结果小麦属内各个种均有扩增曲线出现,而在其它作物没有扩增曲线出现中。结论:该基因与方法可用作检测小麦属(唯一小麦种是栽培作物)内源特异参照基因。