表达人α-1，2-岩藻糖苷转移酶、衰变加速因子和CD59基因的转基因小鼠的建立及其抗异种移植排斥反应的研究

在进行非协调性异种器官移植时,目前已经证实表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）或者补体调节蛋白的供体动物器官均可以部分克服超急性排斥反应．本文的研究目的是探讨是否共表达人HT和补体调节蛋白（衰变加速因子与CD59）的转基因小鼠的外周血单核细胞能更有效的克服异种移植排斥反应．利用受精卵显微注射技术建立转人HT,DAF和／或CD59基因的小鼠动物模型,流式细胞技术筛选表达不同基因的转基因小鼠．将小鼠的外周血单核细胞与15％的人血清共孵育,检测细胞表面天然抗体的沉积、补体的激活以及黏附分子的表达等．三种目的基因均可以在转基因小鼠体内表达,并且HT基因的表达显著减少了引起异种移植排斥反应的主要抗原半乳糖α-1,3-半乳糖（α—Gal）的表达．功能实验表明,与单一目的基因表达的转基因小鼠相比,共表达HT／DAF或HT／CD59的转基因小鼠的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力显著增强．而且三基因共表达的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力最强,可以克服超急性排斥反应并且可以减少黏附分子的表达．高水平表达人HT,DAF和CD59基因的转基因小鼠可以完全克服异种器官移植超急性排斥反应并且可以部分克服急性血管排斥反应．本研究表明,表达三种基因的转基因小鼠的器官异种移植时存活时间可以显著延长,对异种移植来说也许是更合适的选择．     

异种移植中转基因动物技术应用的现状

超急性排斥反应一直是异种移植中的主要障碍,转基因技术为跨越这一障碍发挥了重要作用,转基因技术克服超急性排斥反应的主要技术策略有：利用抗补体基因插入技术创建转基因猪,供体抗原遗传修饰和受体基因治疗。     

克服异种器官移植超急性排异反应的新尝试

克服异种器官移植超急性排异反应的新尝试异种器官移植是解决人类器官移植供体不足的一条途径。但超急性排异反应是异种器官移植的最大障碍。１９９５年１０月在美国波士顿召开的第三届异种器官移植国际会议上,两个研究小组报告了用两种截然不同的思路来解决这一难题的研...     

转基因猪异种器官移植应用前景

转基因猪能为人类提供可移植的异种器官,解决移植器官短缺的问题.但是,异种移植后产生的免疫排斥反应,主要包括超急性排斥反应和迟发性排斥反应,它们最终将导致移植物的致命损伤,是限制异种器官广泛应用的最大障碍.最近的一些研究,在克服免疫排斥方面已经取得了可喜的成果.作为异种器官供体,猪携带的内源性逆转录病毒也可能对人体产生潜在的威胁.迄今,还没有研究证明其不会感染人类机体.本文针对异种器官移植后的免疫排斥发生的机理,克服免疫排斥的方法以及逆转录病毒的潜在感染等方面进行了综述和讨论.     

异种器官移植：前景如何？

目前异种器官移植在进入临床的过程中存在两大难题——免疫排斥和病原微生物感染.人类为防止免疫排斥而采取的措施使超急性排斥得到了很大程度的避免,但大大增加了器官移植受体感染病原微生物的机会.猪作为人类理想的器官供体,却有多种内源性病毒,其中猪内源性逆转录病毒（PERV）引起了人类较大的关注.PERV的跨种感染存在正、反两方面的证据,使得异种器官移植的前景喜忧掺半.     

绿色荧光蛋白在α-1,3半乳糖基转移酶敲除猪组织器官的表达分析

猪是人类异种器官移植的理想供体,然而猪-人的异种器官移植会产生剧烈的排斥反应。虽然已制备的α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除（Galactosyltransferase gene knockout, GTKO）猪可有效缓解猪-人异种器官移植引起的超急性免疫排斥,但缺少报告基因直观示踪移植后的细胞迁移及器官排斥状态。本文将CAG启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）的表达载体导入GTKO猪耳成纤维细胞,通过体细胞核移植技术制备了EGFP猪。利用双荧光蛋白观测镜、荧光显微镜及定量PCR扩增观察、检测和分析克隆猪各组织器官中EGFP蛋白和转录本的表达状况。结果显示,EGFP蛋白及转录本在克隆猪各组织器官中均有表达,但在肝脏和中枢神经系统中表达较弱。本文成功获得了各组织器官表达EGFP的GTKO猪,为EGFP示踪异种细胞组织移植奠定了基础。     

绿色荧光蛋白在α-1,3半乳糖基转移酶敲除猪组织器官的表达分析

猪是人类异种器官移植的理想供体,然而猪-人的异种器官移植会产生剧烈的排斥反应。虽然已制备的α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(Galactosyltransferase gene knockout,GTKO)猪可有效缓解猪-人异种器官移植引起的超急性免疫排斥,但缺少报告基因直观示踪移植后的细胞迁移及器官排斥状态。本文将CAG启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达载体导入GTKO猪耳成纤维细胞,通过体细胞核移植技术制备了EGFP猪。利用双荧光蛋白观测镜、荧光显微镜及定量PCR扩增观察、检测和分析克隆猪各组织器官中EGFP蛋白和转录本的表达状况。结果显示,EGFP蛋白及转录本在克隆猪各组织器官中均有表达,但在肝脏和中枢神经系统中表达较弱。本文成功获得了各组织器官表达EGFP的GTKO猪,为EGFP示踪异种细胞组织移植奠定了基础。     

异种移植中Galα(1,3)Gal抗原的研究近况

同种异体组织和器官移植物供体来源有限,使得异种移植再度成为移植领域的研究热点。异种移植的主要障碍是人体内存在的天然抗体与移植物表面含有α1,3半乳糖残基[Galα(1,3)Gal,αGal]的抗原结合,激活补体系统和炎症反应,导致超急性移植排斥反应(HAR)的发生,使移植物失活。除人类和旧世纪猴外,其它所有哺乳动物的体内都含有αGal抗原,该抗原是由一组具有Galα(1,3)Gal双糖末端的糖蛋白或糖脂组成的,它的形成依赖于α1,3半乳糖基转移酶(αGT)的催化。目前,针对αGal抗原克服超急性移植排斥反应的方法主要有如下几种：(1)酶处理去除内皮细胞表面的αGal抗原;(2)物理化学方法去除人体血浆中存在的特异性天然抗体;(3)基因工程方法改造表达催化αGal抗原形成的相关酶基因,从而影响该抗原的表达。     

用补体控制因子阻止异种移植排斥反应

京都府立医科大学第2外科教授周隆宏、赤见敏和和东雪基础研究所小组确认表达人补体抑制因子CD59基因的小鼠细胞株可避免人淋巴细胞的攻击。如能抑制排斥反应,将使异种移植的实用化前进一大步。赤见等于9月在东京召开的日本移植学会上发表了这项成果。该小组将阻碍补体反应的终因子(C9因子)活化的人细胞表面分子CD59的cDNA导入小鼠细胞株(A31)。重组A31细胞与人血清反应时,由补体介导的细胞障碍随血清浓度不同(3～25％)而抑制程度不同(浓度8％时能抑制94％、浓度25％抑制47％)。异种移植的最大难关是超急性排斥反应。在移植患者的血液流入移植脏器血管的同时引起排斥反应。     

基因修饰猪作为异种器官移植供体的研究进展

器官移植是治疗脏器器官终末病变的根本方法,目前器官移植的最大障碍是供体器官的缺乏。异种器官移植为解决上述难题打开了一扇门。猪与人类在解剖学和生理学等方面非常相似,是理想的器官移植的供体。基因修饰猪在异种器官移植中有着重要的应用,该文就猪–人异种器官移植发生免疫排斥的机制及其对策、器官移植后的生理功能以及潜在的病毒感染风险等方面的研究进行了综述和讨论,为异种器官移植提供理论基础。     

猪作为异种器官移植供体的研究进展

异种器官移植是现代和未来医学的重要研究领域之一,转基因猪有望为人类提供移植所需的器官,本对猪作为异种器官移植供体的可能性,移植引起的免疫排斥反应及病毒感染等问题进行了综述和讨论。     

人α-半乳糖苷酶转导克服异种移植HAR的小鼠实验研究

α 半乳糖苷酶可以特异地清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 (Galα1,3Galantigen) ,此抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (HyperacuteRejection ,HAR)的主要异种抗原 .将构建好的α半乳糖苷酶转基因载体通过显微注射的方式注入小鼠受精卵 ,培育出了转基因小鼠 .结果表明 ,转基因小鼠的心、肝、肾、脾、肺组织中均有人α 半乳糖苷酶基因的表达 ,其表达可以有效减少小鼠器官表面Galα1,3Gal抗原的表达水平 ,可以降低转基因小鼠脾细胞对补体介导的杀伤作用的敏感性 .研究表明人源α半乳糖苷酶基因可用于研制不表达Galα1,3Gal抗原的转基因动物 ,从而可以降低异种器官移植HAR的反应强度 ,提高移植物的存活期     

转基因猪作为人类器官移植供体

美国明尼苏达大学的巴赫博士及其研究组最近提出:猪是人类器官移植的理想供体,因为它的大小与人相仿,而且来源丰富。问题是,猪和人是不同的物种,种间移植引起的所谓超急性排斥反应,其严重程度远远超过人与人之间的器官移植,而且不是药物所能消除的。巴赫等发现,人体在异体(猪)的糖蛋白的作用下可以形成补体,摧毁移植物的正是它们。但目前巴赫博士等又发现了一些可抑制人体内补体作用的化合物,并且     

转基因猪提供移植器官

美国明尼苏达大学的研究者们提出了一个设想:生产基因工程猪作为人类器官移植的器官供体.目前,移植器官的人类供体不足,并且很难找到匹配的器官.这就是说许多需要进行器官移植的患者,将得不到器官. 为了食用已大量繁殖动物,所以用饲养动物作为器官供体在道德问题上可能不会有争议.根据动物的大小及可用性,最适合的动物可能是猪. 在进行上述手术之前,必须解决因排异反应产生的问题.人:人移植也会引起一些排异反应,但通常可用药物加以解决.然而在异种移植体上会发生更严重的超急性排斥反应,被移植的器官将遭到人免疫系统非常强烈的攻击,几小时内该器官被破坏,以致于失去正常的功能.     

中国版纳小型猪近交系动脉异种移植靶抗原研究

目的　研究中国版纳小型猪近交系动脉的异种靶抗原α -Gal的分布和半定量分析 ,为研究异种移植超急性排斥反应和异种生物材料提供资料。方法　通过亲和免疫组织化学法和图象分析对 10头版纳小型猪的四级动脉进行α Gal的分布和半定量研究。结果　 (1)各级血管组织中血管内皮细胞阳性表达明显 ,弹性纤维、胶原纤维和平滑肌细胞未见表达 ,外膜有微弱表达 ;(2 )图象分析显示 ,管径越细 ,其内皮细胞的表达越高 (P <0 .0 1) ,各级动脉内皮细胞阳性表达的面积密度比的组间差异显著 (P <0 .0 1) ,t检验发现每两组间的动脉内皮细胞阳性表达面积密度比相差显著 (P <0 .0 1)。结论　 (1)版纳小型猪动脉内皮细胞均有异种抗原α Gal分布 ,但是分布不均匀 ;(2 )微血管血栓是异种移植超急性排斥反应中的重要环节 ,小型猪的异种器官移植、彻底解决异种移植超急性排斥反应的关键是防治微血管栓塞     

人补体调节蛋白DAF、MCP在哺乳动物细胞中的共表达及协同作用研究

利用双启动子构建含人补体调节蛋白DAF和MCP cDNA的双顺反子重组表达载体pcDNA3-DAFMCP-DP, 以磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞, 用G418筛选获得NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP转化细胞。PCR实验结果显示人补体调节蛋白基因DAF和MCP整合在转化的异源细胞的染色体上。RT-PCR和Western blot印迹实验分别从RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白分子DAF和MCP在细胞系中皆获得同步表达。检测连续传代30次的NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP结果表明人DAF和MCP基因仍稳定整合在细胞基因组中, 并未随着传代而丢失, 为稳定的转双基因细胞系。补体依赖的细胞毒反应表明, pcDNA3-DAFMCP-DP转染细胞系由于DAF和MCP的共表达获得较DAF或MCP单一表达时更强的保护能力, 能更好地抑制人补体依赖的细胞毒作用的发生, 保护宿主细胞免受人补体的攻击。以上结果表明, DAF和MCP双基因重组表达载体实现了人补体调节蛋白基因高效转移和高水平共表达, 为获得表达多种人补体调节蛋白的理想供体提供了有效策略。而且共表达的DAF和MCP具有协同效应, 能更有效地阻止补体激活造成的细胞损伤, 在克服超急性排斥反应的基因治疗中具有潜在的临床应用价值。     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应     

补体调节蛋白作为靶向补体抑制剂的研究进展

补体是机体免疫系统的重要组成部分,补体系统的过度激活,会直接或间接地导致机体自身组织损伤。补体抑制剂是一类具有调节补体功能的调节蛋白,能够抑制补体过度激活,减轻机体的免疫损伤。将补体抑制剂应用于某些疾病的治疗已经有十多年的历史,但人们已经认识到补体的某些抑制物由于其特异性不强,可能会导致机体系统性的补体抑制,产生副作用。目前,通过利用具有靶向作用的补体抑制剂来抑制补体级联反应中特定蛋白的功能或干扰中性粒细胞同血管内皮细胞的黏附等在许多动物模型中已获得了成功,其中有一些研究成果已经开始应用于临床。本文对补体调节蛋白家族中部分成员作为靶向补体抑制剂的研究进展作一综述。     

转人源免疫球蛋白猪胚胎的研究进展

转基因猪能够为人类提供可移植的异种器官,从而缓解临床医学应用上供体移植器官短缺的压力.本文综述了异种器官移植后发生免疫排斥的研究进展,讨论了应用原核显微注射法和精子栽体法生产转人源免疫球蛋白基因(DAF、MCP、CD59)巴马香猪胚胎的方法,力争为解决异种移植的技术"瓶颈"提供技术支撑,为后续的异种器官移植做初步的研究.