磷脂酶Dδ参与植物的低温驯化过程

对经低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶Dδ（PLDδ）基因敲除突变体与野生型植株进行冻害胁迫处理后,比较2种基因型植株的抗冻性。结果发现,经低温驯化的PLDδ敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,而未经低温驯化的PLD礅除突变体与野生型的抗冻性没有显著差异,表明PLDδ参与植物的低温驯化过程。对PLDδ的作用途径进行分析,发现PLDδ在低温驯化过程中不参与抗氧化酶活性的调节,对脯氨酸和可溶性糖的积累起负调节作用,但是参与低温信号转导物质ABA诱导抗冻性的过程。     

磷脂酶Dα在拟南芥低温驯化过程中的作用途径分析

本研究对低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶α基因敲除突变体与野生型拟南芥植株进行冻害胁迫处理后,通过观测植株表型和膜离子渗漏率的变化,鉴定两种基因型植株的抗冻性.结果发现,低温驯化后,PLDα敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,表明PLDα参与植物的低温驯化过程.对其作用途径进行分析发现,PLDα不参与低温驯化过程中ABA信号转导作用,也没有参与SOD、CAT和POD等3种抗氧化酶活性的调节,但是参与低温驯化过程中膜稳定性调节和渗透调节过程.     

磷脂酶Dδ参与植物的低温驯化过程

对经低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶Dδ (PLDδ)基因敲除突变体与野生型植株进行冻害胁迫处理后, 比较2种基因型植株的抗冻性。结果发现, 经低温驯化的PLDδ敲除突变体的抗冻性明显低于野生型, 而未经低温驯化的PLDδ敲除突变体与野生型的抗冻性没有显著差异, 表明PLDδ参与植物的低温驯化过程。对PLDδ的作用途径进行分析, 发现PLDδ在低温驯化过程中不参与抗氧化酶活性的调节, 对脯氨酸和可溶性糖的积累起负调节作用, 但是参与低温信号转导物质ABA诱导抗冻性的过程。     

拟南芥中磷脂酶Dγ2的低温信号转导作用途径分析

磷脂酶D(PLD)的磷脂降解功能和信号转导功能均能影响植物的抗冻性.本研究以PLDγ2基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,随后由这两种植株的表型及其离子渗透率等来分析PLDγ2基因对拟南芥抗冻性.结果发现,经直接冻害处理后,PLDγ2敲除型的抗冻性与野生型基本一致;但经过低温驯化后的冻害处理,PLDγ2敲除型的抗冻性弱于野生型,即表明PLDγ2基因参与了低温信号转导作用.进一步的实验结果表明PLDγ2基因介导脯氨酸调控的可溶性物质调控途径和过氧化物酶(POD)活性调控的抗氧化系统途径;但是与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径.     

磷脂酶Dβ在拟南芥低温信号中的转导作用

磷脂酶D(PLD)不仅是植物中一类主要的磷脂水解酶,而且是一类重要的跨膜信号转导酶类.PLD的磷脂降解功能和信号转导功能均影响植物的抗冻性.本研究以PLDβ基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型植株为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,并分析其作用途径.结果表明,PLDβ基因介导低温信号转导作用,参与渗透调节途径中脯氨酸的调控和抗氧化系统中过氧化氢酶(CAT)活性的调控,并且与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径.本研究为探索通过调控PLD的活性提高植物抗冻性提供了新的途径,并为深入揭示植物的抗冻机理以及磷脂信号转导机制提供实验支持.     

干旱胁迫下磷脂酶Dδ和9-脂氧合酶对拟南芥茉莉酸合成及种子萌发的影响

以拟南芥哥伦比亚野生型(WT)、磷脂酶Dδ(PLDδ)缺失型突变体pldδ和9-脂氧合酶(9-LOX)缺失型突变体lox1、lox5实生苗为材料,以0.3 mol·L-1甘露醇模拟干旱胁迫,分析PLDδ和9-LOX参与干旱胁迫下拟南芥茉莉酸(JA)生物合成和在种子萌发中作用。结果表明:干旱胁迫显著提高PLDδ和LOX1基因表达以及PLD和LOX酶活性;干旱胁迫下,pldδ突变体幼苗的LOX活性和JA含量显著低于WT,外源添加磷脂酸(PA)后LOX活性和JA含量显著上升,并高于WT;干旱胁迫显著抑制pldδ、lox1和lox5突变体的种子萌发,以对lox1的抑制效果最为明显;干旱胁迫下PLD活性上升与PLDδ基因表达上调有关,LOX活性上升与LOX1和LOX5基因表达上调有关,其中LOX1基因起主要作用;PLDδ/PA位于9-LOX上游参与9-LOX诱导的JA合成过程;PLDδ、LOX1和LOX5基因均参与干旱胁迫下拟南芥的种子萌发,LOX1在此过程中作用最为明显;PLDδ和9-LOX均参与PA和JA介导的种子萌发过程。     

儿茶素诱导的拟南芥根细胞膜脂变化

儿茶素是一种可以短时间内杀死植物细胞的植物毒素,由于具有强的植物毒性,儿茶素是开发除草剂的理想化合物,它可以诱导植物根系统的死亡.为了研究植物根细胞膜脂对化学胁迫的响应规律,我们运用高通量的脂类组学方法检测了拟南芥根中膜脂分子的组成,比较了儿茶素处理下拟南芥野生型(WS)及磷脂酶Dδ缺失突变体( PLDδ-KO)根中膜脂分子的组成情况、膜脂含量、双键指数及碳链长度值.结果发现,儿茶素处理拟南芥根90 min后,二半乳糖基二酰甘油(DGDG)、单半乳糖基二酰甘油(MGDG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰肌醇(PI)的总含量在WS与PLDδ-KO植株根中都显著下降,磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)在WS中下降,在PLDδ-KO中上升.儿茶素处理导致PLDδ-KO植株的PC/PE比值显著下降,WS植株PS碳链长度显著增加.上述结果说明儿茶素处理后,磷脂酶Dδ缺失突变体膜不稳定性增加,PLDδ-KO植株对儿茶素胁迫更加敏感.     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

干旱胁迫下拟南芥磷脂酶Dδ与一氧化氮在种子萌发中的信号关系

以拟南芥野生型（WT）、一氧化氮合酶（NOS）缺失型突变体（noa1）、硝酸还原酶（NR）缺失型突变体（nia1,nia2）及磷脂酶Dδ（PLDδ）缺失型突变体（pldδ）幼苗为材料,研究了0.3 mol·L^-1甘露醇模拟干旱胁迫响应过程中PLDδ和一氧化氮（NO）之间的信号转导关系。结果显示：干旱胁迫下NO含量,PLD和NR活性及基因相对表达量显著升高,pldδ和nia2较其他突变体对干旱胁迫更敏感;外源添加NO供体硝普钠（SNP）可以提高干旱胁迫下WT,nia2和pldδ的种子萌发,而外源添加磷脂酸（PA）可以促进WT和pldδ的种子萌发,但不能促进nia2的种子萌发;PA可以促进干旱胁迫下WT和pldδ的NO产生,但不能促进nia2中NO的产生。表明：干旱胁迫下PLDδ/PA位于NO信号的上游,且PLDδ/PA主要通过NR2途径产生的NO促进干旱胁迫下拟南芥的种子萌发。     

脱落酸及其类似物与植物抗寒性之间的关系

大量的研究表明,植物体内ABA在低温条件下所起的作用非常重要。ABA参与低温反应得到以下几个方面的支持：(1)在低温期间植物体内的内源ABA含量增加;(2)在非驯化条件下用ABA处理的植株的抗冻性增加;(3)拟南芥菜的ABA合成缺乏突变体aba-1在低温驯化期间受到伤害,但当加入外源ABA时这种缺陷可被弥补;(4)由低温诱导的几种植物体内蛋白质可以由外源ABA所诱导[1]。正因为如此,人们对ABA在低温条件下对植物生长的作用研究得越来越多而深入。本文对近年来ABA及其类似物对植物抗寒性和基因表达调控的影响的研究进展     

拟南芥中磷脂酶Dδ参与机械伤害诱导的磷脂酸生成（英文）

磷脂酶水解磷脂产生磷脂酸(phosphatidic acid,PA),Dα1和δ是磷脂酶D家族中表达丰度最高的两个成员,已知磷脂酶Dα1参与了机械伤害诱导的磷脂酸信号,但是磷脂酶Dδ是否以及如何参与PA信号尚且未知。本研究利用脂类组学分析方法,比较了拟南芥野生型(WS)和磷脂酶Dδ基因T-DNA插入突变体(PLDδ-KO),在机械伤害后的较长时间段(6 h)的膜脂分子变化。结果发现,机械伤害后,拟南芥两种基因型的大部分膜脂均发生下降,且机械伤害后30 min,PA含量即快速并急剧升高;随着时间的延长,其水平持续升高,直至达到峰值后下降至6 h达到最低值。WS和PLDδ-KO达到PA最高值的时间不同,分别为1 h和3 h;在伤害处理后30 min至3 h期间,PLDδ-KO中的PA水平低于WS,两个基因型中的PA含量最大差值为20%,发生在伤害后1 h。这证明缺失PLDδ基因在一定程度抑制了机械伤害诱导的PA生产,表明PLDδ参与拟南芥响应机械伤害的PA生成,但是其响应较PLDα1作用慢且轻。这是PLDδ响应拟南芥中机械伤害的首次报道。     

磷脂酶Dδ对拟南芥叶片衰老过程中内源ROS和激素含量的影响

活性氧(ROS)和植物激素是植物衰老过程中重要的内在或者外在的调控因子.我们发现,相对于离体诱导的衰老过程,在脱落酸(ABA)和乙烯(ethylene)促进的衰老过程中有较多的活性氧积累;在对拟南芥磷脂酶Dδ (PLDδ)缺失型突变体的研究中发现,与野生型相比,突变体在衰老过程中产生较少的活性氧.我们比较了上述两种基因型的离体叶片在离体、ABA和ethylene三种衰老处理下内源的ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)、玉米素核苷(Zeatin Riboside,ZR)和吲哚乙酸(IAA)的含量变化,发现每一种激素对上述三种衰老处理的响应模式都很相似.在离体诱导的衰老中,两种基因型拟南芥的内源激素含量没有差异;而在ABA促进的衰老过程中,PLDδ缺失型突变体叶片中的MeJA的含量较低,ZR和IAA含量较高;在乙烯促进的衰老过程中,突变体中的ABA和MeJA的含量较低,ZR和IAA含量较高.上述内源激素的这种变化可能有助于延缓突变体的衰老.     

香蕉枯萎病菌中Hog1 MAPK同源基因FoHog1敲除突变体的生物学特性

【目的】研究香蕉枯萎病菌4号生理小种中促分裂原活化蛋白激酶基因FoHog1的结构特点及其功能【方法】通过PCR和RT-PCR的方法获得了FoHog1基因序列并进行生物信息学分析,利用PEG介导的原生质体转化法得到了FoHog1基因缺失突变体,分析敲除突变体与野生型的生物学特性差异【结果】FoHog1基因编码一个含有357个氨基酸的蛋白,该蛋白在不同种镰刀菌中高度保守。通过对敲除突变体的研究发现,该基因缺失后菌丝密度下降,产孢量与菌丝干重明显降低,对乙酸钠和氯化铵的利用率下降,对温度、pH及渗透压等外源胁迫更为敏感。通过致病力实验发现,基因敲除突变体的定殖能力有所降低【结论】尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中FoHog1基因参与调控菌丝生长、分生孢子生成、乙酸钠和氯化铵代谢、渗透压胁迫反应及致病相关过程。     

苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能

【目的】非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用,明确Vm NRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能,将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。【方法】基于苹果树腐烂病菌全基因组数据,得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体,对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体,进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体,最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达,且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异,但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱,且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。【结论】VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。     

大丽轮枝菌VdSCH9基因的功能研究

大丽轮枝菌是一种土传性植物病原真菌,可侵染多种植物并引发黄萎病。目前,人们关于大丽轮枝菌的侵染和致病机制的了解还很不深入。本文通过敲除大丽轮枝菌编码丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶基因VdSCH9,阐明了其在大丽轮枝菌生长发育及致病过程中的作用。SCH9基因在酵母中的表达与cAMP-PKA途径和TOR信号通路相关,对酵母的生长、压力响应和寿命等有重要作用。大丽轮枝菌VdSCH9敲除突变体的生长速率显著下降,菌落边缘菌丝更为稀疏,菌丝分枝减少,对棉花植株为害的平均病情指数为56.6,显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数90.5和82.8,对茄子植株为害的平均病情指数为65.9,也显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数91.1和89.8。另外,敲除突变体对于高渗透压、氧化还原压力、细胞膜和细胞壁完整性等压力条件的敏感性增强。因此,VdSCH9对于大丽轮枝菌的生长、压力响应及致病力均有重要作用。     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

通过花药培养筛选水稻耐镉突变体

通过花药培养筛选出三个水稻耐镉突变体并都获得再生植株。再生植株及由根尖诱导产生的愈伤组织都保持稳定的耐镉性。突变植株的花药经再培养鉴定也具有耐镉性,从而表明所获突变体的耐镉特性是可以遗传的。在对愈伤组织耐镉机理进行的分析中发现,突变体愈伤组织中的胱氨酸和半胱氨酸的含量高于对照。将一定量的胱氨酸加到含镉的培养基中用于检查野生型愈伤组织的增殖情况,观察到胱氨酸可以降低镉对细胞的危害,表明突变体耐镉机理可能与细胞中积累有较多的胱氨酸和半胱氨酸有关。     

水稻OsCatB敲除突变体的构建及耐逆性初步分析

水稻过氧化氢酶B (catalase B, CatB)主要在非光合组织、愈伤组织、根和种子中表达,参与调控活性氧动态水平的平衡和根系的生长。目前, CatB参与非生物胁迫响应的功能在很大程度上是未知的。本研究利用基因编辑技术CRISPR/Cas9获得OsCatB基因敲除的纯合突变体catb,并分析了catb在盐、高温和氧化等胁迫处理下的生理和生化表型。研究结果发现,在盐处理下,突变体catb的生理和生化表型与野生型植株无显著差异;在热胁迫下, catb的过氧化氢酶活性和存活率与野生型植株相比显著降低,而H2O2含量显著升高;在氧化胁迫下, catb的幼苗高度低于野生型。这些结果说明,水稻CatB参与盐胁迫响应的调控不明显,而主要参与了高温和氧化胁迫响应,并正调控水稻的高温和氧化胁迫耐受性。该研究为进一步探究Os CatB参与逆境响应的分子机制和培育抗逆水稻品种提供了一定的理论指导和遗传材料。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

拟南芥CtpA纯合突变体的光合生理特征

以T-DNA插入获得的拟南芥at3g57680基因缺失的CtpA纯合突变体植株为材料,检测了其与光合作用相关的生理特征,以揭示拟南芥at3g57680基因功能和其编码的CtpA蛋白的作用.结果显示:拟南芥的CtpA突变体植株在整个生长过程中都略小于野生型植株,但能够健康生长;CtpA突变体的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b和叶绿素a+b值, PSⅠ、PSⅡ和光合电子传递总链的电子传递活性,以及77K低温荧光波谱都与野生型植株无显著差异(P>0.05);CtpA突变体植株的最大光化学量子产量(Fv/Fm)和有效光化学量子产量(ΦPSⅡ)也与野生型无显著差异,而光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)值在室温下显著低于野生型(P<0.05).研究表明, 拟南芥at3g57680基因在正常条件下对植株生长无显著影响,可能不是编码CtpA蛋白的关键基因.