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利用Tag DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
应用TaqDNA聚合酶直接对RNA进行反转录成cDNA第一链,然后用特异引物进行PCR扩增,结果表明,反转录达到AMV逆转录酶的效果,且可能得到比AMV逆转录酶更完整的cDNA第一链。 相似文献
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本文讨论了检测丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的样本来源和处理,引物的设计,合成和选择等问题;重点介绍了蛋白酶K消化法,聚乙二醇沉淀法,异硫氰酸胍一步法,硅凝胶提取法和直接捕获法提取HCV RNA的5种方法,以及一步PCR法,常规RT-巢式PCR,直接RT-巢式PCR,化学修饰的RT-巢式PCR,联合PCR,双温PCR和定量竞争性PCR等7种PCR方法检测HCV RNA,用PCR检测HCV RNA方法的标准化以及检测HCVRNA具有非常重要的意义。本文还介绍了一种新型的定量方法-bDNA信号放大技术检测HcVRNA。 相似文献
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超高忠实性PCR用DNA聚合酶 总被引:4,自引:0,他引:4
PCR(PolymeraseChainReaction)法已在生物工程领域得到了广泛的应用,而PCR法的推广完全得益于Taq耐热性DNA聚合酶。近年来,PCR法的应用除生物工程领域外,已应用至工业、农业、医学、制药等与人们生活息息相关的各个领域。随着PCR法的不断推广,人们对DNA聚合酶的忠实性(Fidelity)要求越来越高,一般来说,TaqDNA聚合酶在进行PCR延伸反应过程中的错配率为0.5%左右。TaKaRa公司独自研制成功的PyrobestDNA聚合酶是一种来源于Pyrococcuss… 相似文献
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丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT-PCR方法的比较 总被引:1,自引:0,他引:1
采用HCV基因组结构区C区cDNA探针和非结构区NS3-4区cDNA探针,建立了用打点杂交(dotblothybridization)检测血清中HCVRNA的方法,同采用HCV基因组5’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测血清中HCVRNA的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中HCVRNA,但RT-PCR法敏感性优于RNA打点杂交法。对于无血清学指标的慢性NANB肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及RNA提取方法。RT-PCR法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究HCVRNA量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的HCVRNA阳性样本。 相似文献
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扩增大段靶DNA的PCR方法 总被引:3,自引:0,他引:3
扩增大段靶DNA的PCR方法陈尚武,王章(中山大学生命科学学院,广州)PCR和分子克隆是扩增遗传物质的常用技术。热稳定Taq(Thermusaquaticus)DNA聚合酶的应用以及PCR技术所固有的迅速、简便、廉价等优点,使DNA片段的PCR扩增成... 相似文献
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随机扩增多态DNA影响因素的研究 总被引:76,自引:0,他引:76
随机拉多态DNA分析受诸多因素的影响,我们发现不同厂家制造的PCR扩增仪,不同厂家出品的TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液,RAPD反应体系中的引物浓度,Mg^2+浓度,dNTP浓度,BSA和明胶,以及模板DNA的量等均可能对RAPD结果有不同程度的影响。 相似文献
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采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)302bp的cDNA片段,经补齐和提纯后插入pUC19质粒,获得的重组体pUN进行序列测定。将pUN的目的基因亚克隆进体外转录载体pSPORTI多克隆位点的EooRI和PstI切点之间,所得重组体pSN线性化后由T_7RNA多聚酶及SP6RNA多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物RT-PCR,证实SP6引导的是正义RNA,T7合成的是反义RNA,其大小分别力429bp和362bp。并证实所得RNA力HCV5'NCRcDNA转录而来。获得的HCV5'NCRcDNA和RNA在常规逆转录和PCR步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,HCV5'NCR体外转录载体的构建可用于制各RNA探针和反义RNA,改进后还可作为定量PCR的竞争性模板。 相似文献
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Ⅰ型人免疫缺陷病毒逆转录酶在抗感染及AIDS治疗药物的设计中是一个重要的靶分子,并且可作为工具酶应用于逆转录PCR等分子生物学研究中。本研究将HIV-1RT基因经PCR扩增并修饰后克隆入大杆菌表达载体pBV220,所获重组子所表达的HIV-1RT蛋白占菌体总蛋白的8%左右,且经〔^3H〕dTTP掺入法证实该重组HIV-1RT具有RT聚合酶活性。用Q-Sepharose层析柱对重组HIV-1RT蛋白 相似文献
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PCR产物克隆方法的新进展 总被引:2,自引:0,他引:2
PCR产物克隆方法的新进展陈尚武,马涧泉(中山医科大学生化教研室.广州)随着PCR技术的发展和普及,克隆PCR产物已广泛应用于分子生物学的各个领域。通常PCR产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,由于TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性... 相似文献
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FD耐热逆转录酶的部分酶学性质研究 总被引:6,自引:0,他引:6
FD耐热逆转录酶(FD-TRT)来自一株栖热杆菌菌株.通过RT-PCR方法,论文对FD-TRT的部分酶学性质进行了研究.FD耐热逆转录酶能耐受95℃的高温,最适反应温度在65~75℃左右,这时RNA的高级结构能解开,可以提高逆转录反应的效率;同时引物和RNA模板识别的专一性强,可大大提高逆转录的特异性.实验表明FD-TRT逆转录反应的最适条件为:25mmol/LTris-HCl(pH8.8,15mmol/L(NH4)2SO4,100μg/ml明胶,500μmol/LdNTPs,25pmol逆转录引物,1mmol/LMnCl2,2UFD耐热逆转录酶,反应在65~70℃下进行.在上述条件下,用RT-PCR可检出少于5pg外周血总RNA中特异的α珠蛋白mRNA. 相似文献
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本文采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对212例住院及门诊病人其中肝病患者98例(慢性肝炎43例、肝炎后肝硬化47例、原发性肝细胞癌8例)进行HCV-RNA检测。结果98例慢性肝病患者血清中HCV-RNA-PCR阳性27例(27.6%),114例非肝病患者血清中HCV-RNA-PCR阳性9例(7.9%),两组间差异非常显著(P〈0.01),各种肝病患者的HCV-RNA-PCR阳性率均高于 相似文献
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用RT-PCR方法快速克隆了Wistar大鼠脑神经元特异性烯醇化酶(NSE)的cDNA,将此包括编码全长NSE433个氨基醚的DNA片段重组入pUC质粒,并用PCR方法测定了全部顺序,经重复实验,发现Wistar大鼠与Forss-Petter报导的SD大鼠NSE基因顺序,有两外单碱基的差别,其中一个涉及氨基酸的改变。同时还对RNA的提取及长片段DNA的RT-PCR扩增进行了方法学的探讨。 相似文献
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为了探讨人肥胖基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列(CDNA),定向亚克隆至PUC19质粒,克隆的OBCDNA不含信号肽序列并加入了亲折起始密友子ATG〈序列分析表明,与日本报道的人OBCDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG,将OBCDNA定向克隆至原功体PBV220,构建了重组OB基因表达质粒PBV 相似文献
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应用反转录—聚合酶链反应检测口蹄疫病毒 总被引:9,自引:0,他引:9
建立了一种适用于检测动物(猪、牛、羊)组织(肌肉、淋巴结、脊髓、扁桃体和蹄冠皮)和牛食道-咽部分泌物(O-P液)中的口蹄疫(FMD)病毒核酸(RNA)的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。引物对是人工合成的两条20mer寡核苷酸片段,它们的序列相应于FMD病毒结构蛋白VP1基因后2/3区段,在4个血清型之间基本一致(保守)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。试验结果表明,RT-PCR具有良好的 相似文献
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用于扩增较大片段DNA的PCR方法方向东,陈淳(中科院上海生物化学研究所国家分子生物学实验室,上海200031)诸江(上海第二医科大学上海血液学研究所,上海200025)关键词DNA扩增,PCR自从Taq(Thermusaquaticus)DNA聚合... 相似文献
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将克隆载体平端切割后,向反应体系中加入dTTP,用TaqDNA聚合酶处理载体,使其3-端带上一个凸出的单碱基T,修饰后的载体可直接与纯化的PCR产物连接。 相似文献
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