膜联蛋白AnxB1序列缺失突变体的结构模建及活性分析

为获得低分子量、低免疫原性的膜联蛋白AnxB1的序列缺失突变体 ,以AnxB1C端的 4个内部同源结构域为基础 ,模拟构建了 4个突变体群 .利用同源模建的方法对各突变体进行结构模建和分子优化 ,最后选择 4个结构最为合理的突变体在大肠杆菌GST融合表达系统中表达 .结果显示 :GST M3和GST M4均表达出较强的抗凝血活性 ,且免疫原性也降低为原来的 1 2 ,为进一步构建兼具抗凝、溶栓双重功能的靶向性溶栓药物奠定了基础 .     

大肠杆菌CM/PDT抗反馈抑制突变体的构建及其性质

为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 (chorismatemutase prephenatedehydrataseCM PDT) [EC5 .4 .99.5 EC4 .2 .1.5 1],通过相关菌种CM PDT氨基酸序列同源比较 ,寻找高度保守位点 .用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失 30 4T、30 5G、Q30 6K)、M2 (缺失W 338)、M3(缺失 30 1～ 386位氨基酸 )、M32 9(E32 9A)和M374 (C374A) ,野生型及各突变型基因与pET2 8a(+ )载体连接后 ,表达融合蛋白 .在非变性条件下 ,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白 .酶活性测定表明 ,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的 2 9% ,但保持了CM活性 .突变体M374保持了CM ,PDT两种酶的活性 ,突变体M1、M2、M32 9的CM ,PDT活性有一定程度的提高 .酶抗反馈抑制作用检测表明 ,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ,M1、M2、M32 9部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 .与含野生型pheA基因的E .coliBL2 1菌株相比 ,含突变基因的E .coliBL2 1菌株对 10mmol L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用 ,其中M1,M2 ,M3对 2 0mmol L的类似物具有抗反馈抑制作用     

人类红细胞膜带3蛋白C端域Lys892～Phe895在Cl~-转运过程中作用的研究

采用酵母表面展示系统 ,表达带 3蛋白膜段结构域 (Gln4 0 4～Val911)至酵母细胞膜 ,功能研究表明 ,表达后的膜段结构域具有离子转运的活性 ,同时 ,带 3蛋白抑制剂 4 ,4′ 二异硫氰 2 ,2′ 二黄酸芪 (DIDS)能够抑制其离子转运的功能 .利用PCR方法 ,以 pFAST Bac mdb3为模板扩增出带 3蛋白膜段结构域的 4种截断突变体 ,分别去除带 3蛋白C端域后 4个 (Ala90 8～Val911)、 16个 (Asp896～Val911)、 2 0个 (Lys892～Val911)、 32个(Asn880～Val911)氨基酸序列 ,测序后将其克隆至表达载体 pYD1上 ,构建酵母表达质粒 pYD1 Trunc4、pYD1 Trunc16、pYD1 Trunc2 0和 pYD1 Trunc32 ,诱导 4组突变体的蛋白质表达 .然后测定Cl-的转运活性 ,结果发现去除后 2 0个 (Lys892～Val911)氨基酸残基后 ,离子转运活性明显下降 ,而去除后 32个 (Asn880～Val911)后 ,离子转运没有进一步下降 ,说明Lys892～Phe895 4个氨基酸残基在带 3蛋白的离子转运过程中发挥重要作用     

炭疽毒素保护性抗原的不同结构域对其表达可溶性的影响

目的：对炭疽毒素保护性抗原（PA）的不同结构域进行了缺失突变,以期找到免疫原性降低而功能变化不大的PA蛋白突变体。方法：在对PA结构域的缺失突变体进行表达时,意外发现不同的突变体表达效果之间存在很大差异,遂用DNAStar软件对PA的4个结构域和突变体进行分析。结果：PA蛋白结构域2的表面特性与其他结构域存在很大差异。结论：推断这种表面特性影响了PA突变体的可溶性特征。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba结构域Ⅱ中Loops结构与功能关系研究

为了明确杀虫晶体蛋白中各个Loop的结构与功能的关系,以及Loop突变对Cry1Ba蛋白杀虫活性的影响,首先通过三维结构模拟以及同源序列分析的方法,找到Cry1Ba蛋白三个结构域及三个Loop相对应的氨基酸片段:然后通过重叠引物PCR将编码Cry1Ba蛋白结构域Ⅱ中的三个Loop进行了相应的突变,共获得了5个突变体M1(Loop1:340WSNTR344-缺失(Cry1A))、M2(Loop2:402Y-G)、M3(Loop2:400GIYLEP405-PSAV(Cry3A)),M4(400GIYLEPIH407-ILGS(Cry1A)),M5(Loop3:472LQSRV476-AGAVYTL(Cry1A)).将这些突变体在大肠杆菌BL21中进行了诱导表达,提取蛋白,分别对小菜蛾进行了生物活性测定.生测结果表明,Loop1的缺失突变M1的毒力,与Cry1Ba(LC50 0.96μg/mL)相比,显著降低,LC50为35.51 μg/mL;在Loop2的突变中,单个氨基酸的突变M2(Y/G)的毒力略有下降(LC50为1.31 μg/mL);而另两种突变(M3和M4)时小菜蛾的毒力明显下降,LC50值分别为11.56 μg/mL、34.81 μg/mL;Loop3的突变M5对小菜蛾的毒力略有提高(LC50 0.81 μg/mL),但差异不显著.对Cry1Ba蛋白突变前后结构与功能之间关系的分析结果表明,Loop区突变对Cry1Ba蛋白的结构和功能影响非常显著;Loop1和Loop2在决定Cry1Ba对小菜蛾的毒性方面起着重要作用.     

TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

人同源框基因Lhx4 cDNA序列的获得,染色体定位和基因组分析

Lhx4基因是LIM同源框基因家族的一员 ,它在运动神经元的发育过程中发挥着重要的作用 .从人脊髓cDNA文库中筛选到了 1个人源性Lhx4基因的cDNA全长序列 ,它与鼠源性的Lhx4基因的cDNA序列有 92 %同源性 .它的基因被定位在 1号染色体 1q 2 4 .1- 1q 2 4 .3的位置 ,并包含有 6个外显子 .其中同源框结构域由外显子 4和 5表达 ,LIM结构域 1由外显子 2表达 ,LIM结构域2由外显子 3表达 .     

人类红细胞膜带3蛋白C端域Lys892～Phe895在Cl-转运过程中作用的研究

采用酵母表面展示系统,表达带3蛋白膜段结构域(Gln404～Val911)至酵母细胞膜,功能研究表明,表达后的膜段结构域具有离子转运的活性,同时,带3蛋白抑制剂4,4′-二异硫氰-2,2′-二黄酸芪(DIDS)能够抑制其离子转运的功能.利用PCR方法,以pFAST-Bac-mdb3为模板扩增出带3蛋白膜段结构域的4种截断突变体,分别去除带3蛋白C端域后4个(Ala908～Val911)、16个(Asp896～Val911)、20个(Lys892～Val911)、32个(Asn880～Val911)氨基酸序列,测序后将其克隆至表达载体pYD1上,构建酵母表达质粒pYD1-Trunc4、pYD1-Trunc16、pYD1-Trunc20和pYD1-Trunc32,诱导4组突变体的蛋白质表达.然后测定Cl^-的转运活性,结果发现去除后20个(Lys892～Val911)氨基酸残基后,离子转运活性明显下降,而去除后32个(Asn880～Val911)后,离子转运没有进一步下降,说明Lys892～Phe895 4个氨基酸残基在带3蛋白的离子转运过程中发挥重要作用.     

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第 6外显子可能是一个与TFAR19促凋亡活性密切相关的功能结构域     

FHL2转录激活结构域的定位

LIM蛋白家族成员FHL2 (fourandhalfLIMdomainprotein)在转录调节、细胞凋亡及肿瘤的发生发展中都起着重要作用。利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域 (DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4 LUC)构建了哺乳动物细胞转录激活系统 ,并利用该系统定位了FHL2的转录激活结构域。首先将GAL4 DBD序列以正确读框插入到pcDNA3载体的多克隆位点中 ,构建成真核表达载体pDBD ,再将野生型FHL2及其不同片段以正确读框与pDBD中GAL4 DBD序列融合 ,构建成野生型FHL2及其缺失突变体表达载体。将这些表达载体分别瞬时转染 2 93T胚胎肾细胞 ,野生型FHL2及其缺失突变体都得到了表达。利用GAL4 荧光素酶报告基因对野生型FHL2及其不同突变体的转录激活活性检测表明 ,在 2 93T胚胎肾细胞和乳腺癌MCF 7细胞中 ,野生型FHL2具有转录激活活性 ,缺失N端半个LIM结构域使FHL2转录激活活性降低 ,缺失C末端第二个LIM结构域对FHL2的转录激活功能影响不大 ,缺失C末端最后一个LIM结构域则使FHL2的转录激活功能完全丧失 ,而C末端缺失 2个LIM结构域使FHL2转录激活活性又有所恢复。这说明FHL2C末端最后一个LIM结构域对其转录激活功能是必需的 ,而C末端第二个LIM结构域可能对FHL2的转录激活功能有负调控作用 ,这种负调控作用取决于