维生素C二步发酵中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的影响

通过测定氧化葡萄糖酸杆菌转化L－山梨糖中成ZKGA的细胞酶活性、摇瓶发酵及中长变化,研究了Vc:步发酵中巨大茅孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸作用的影响。结果显示：巨大芽孢杆菌胞外液和胞内液均可促进氧化葡萄糖酸杆菌的增殖,主要表现为缩短其中长周期中的延迟期;巨大芽孢杆菌通过所产生的部分生物活性物质增强氧化葡萄糖酸杆菌产酸的细胞酶活性,促进氧化葡萄糖酸杆菌转化L一山梨糖生成2KGA.     

巨大芽孢杆菌B．m2980产孢对氧化葡萄糖酸杆菌产酸的影响

为确定维生素C二步发酵中巨大芽孢杆菌（伴生菌）芽孢形成对氧化葡萄酸杆菌（产酸菌）产酸的影响,本研究通过对巨大芽孢杆菌生长特性分析,选取培养12h（未形成芽孢）和36h（芽孢大量形成）巨大芽孢杆菌B．m2980,检测其胞外液、胞内液以及混合液对产酸菌生成2-酮基-L-古龙酸的影响。结果表明,在未开始形成芽孢时,伴生菌胞外液、胞内液及混合液对产酸菌的生长和产酸有较低的促进作用,其中胞内液的促进能力大于胞外液;在芽孢生成后,胞外液以及混合液对产酸菌生长和产酸的促进能力显著提高。     

2—KLG产生菌混合发酵特性及最佳混生模式的研究

氧化葡萄糖酸杆菌合成的2－KLG对巨大芽孢杆菌的生长繁殖具有明显的抑制作用,可缩短其生长周期。发酵体系中巨大芽孢杆菌的存在是氧化葡萄糖酸杆菌的生长繁殖和合成2－KLG所必需的,发酵过程中巨大芽孢杆菌裂解所释放的活性物质可能是刺激氧化葡萄糖酸杆菌合成2－KLG的主要原因。二菌混合发酵需在适宜的混生模式下才可达到最佳效果。     

Vc 二步发酵中的微生物生态调控

研究了Vc二步混合菌发酵中氧化葡萄糖酸杆菌与巨大芽孢杆菌的生长和相互作用。结果表明,2株混合菌在发酵中可形成一种协同共生,促进2－酮基－L－古龙酸产生;二菌协同共生的过程及条件不同,促进产酸能力亦不同。环境因子影响二菌协同共生,优化环境因子可显著改善二菌协同共生效率,并提高醇到发酵转化率。     

巨大芽孢杆菌在维生素C二步发酵中的作用

巨大芽孢杆菌培养时期不同其上清液对促进氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸能力不同,在稳定期及衰亡初期显著促进氧化葡萄糖酸杆菌生长与产酸.pH、温度可改变上清液对氧化葡萄糖酸杆菌生长与产酸的影响.上清液中含活性物质具有蛋白质的部分性质,对酸、碱、热敏感.     

Vc二步发酵中伴生菌的作用机制

应用细胞培养和膜分离技术研究了Vc两步发酵中伴生菌巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）对氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）产酸作用机制。结果表明：巨大芽孢杆菌培养液中分子量在30－50kD及大于100kD组分明显促进产酸：其组分通过凝胶怪析分离纯化,自动紫检测仪检测（280nm）,聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮兰G250特异染色,初步证实为蛋白质,且至少是两种以上蛋白质,它们在低温下稳定性较好。     

VC三菌种一步发酵方法的构建与研究

就维生素C微生物一步发酵方法进行了探索,构建了酮古龙酸杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌和芽孢杆菌三菌混菌一步发酵的方法。研究发现,植物内生芽孢杆菌可以与酮古龙酸杆菌配合,促进酮古龙酸杆菌生长和产酸。在有山梨醇存在的条件下酮古龙酸杆菌及其伴生菌能够快速地生长增殖,植物内生芽孢杆菌在发酵的10h中不断消耗山梨醇。5L的发酵罐中,酮古龙酸杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌和植物内生芽孢杆菌三菌混菌一步发酵在恒定的30℃温度,600r/min搅拌速度和1.5vvm通气条件下,补料发酵过程中醇酸质量转化率达到了81.89%,在分批发酵过程中,醇酸质量转化率达到了87.90%,进一步优化了维生素C生产工艺。     

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329的培养及保存

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329和苏云金芽孢杆菌SCB933是混合发酵产生维生素C前体2－KLG两株主要菌种,本文对氧化葡萄糖酸杆菌SCB329的纯培养,传代及纯小菌的保存及其对产酸的影响作了研究。     

Vc二步发酵中的微生物生态调控

研究了Vc二步混合菌发酵中氧化葡萄糖酸杆菌与巨大芽孢杆菌的生长和相互作用.结果表明,2株混合菌在发酵中可形成一种协同共生,促进2酮基L古龙酸产生;二菌协同共生的过程及条件不同,促进产酸能力亦不同.环境因子影响二菌协同共生.优化环境因子可显著改善二菌协同共生效率,并提高醇酸发酵转化率.     

维生素C二步发酵中离子注入诱变巨大芽孢杆菌的生物学效应

巨大芽孢杆菌BM279是经低能N 离子注入诱变原始菌株BM80而得到的维生素C高转化率伴生菌株。通过对离子注入前后出发菌和突变株的生理、生化等生物学特点比较,探讨了离子注入巨大芽孢杆菌对2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高转化率的促进机理。离子注入对巨大芽孢杆菌自身的生长无明显影响,BM279呈现出与BM80基本一致的生长曲线;但BM279对混菌发酵体系中产酸菌GO29的细胞增殖有显著促进作用。BM279在混菌发酵过程中分泌较多的碱性物,有利于维持GO29生长、代谢的pH环境。BM279培养42 h,其胞外活性物质对GO29的糖酸转化活力较BM80有显著提高,且分泌时间较BM80推迟6 h。利用层析技术分别从BM80、BM279胞外液中纯化了L-山梨糖脱氢酶(L-sorbose dehydrogenase,SDH)激活蛋白(SSPBM80和SSPBM279),后者比活较前者高出50%,对GO29中的SDH酶活有更强促进作用。     

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）突变株Bn,B5的生物学特性及在Vc二步发酵中的伴生作用

对选出的巨大芽孢杆菌突变株Bn,B5进行了生物学特性及发酵条件的研究,发现它们具耐低pH和抗高浓2KGA特性.可促进氧化葡萄糖酸杆菌生长,使其延迟期缩短,产酸增加.适宜的通气量下,摇瓶糖酸转化率提高10%～14%;当发酵pH为6.2～6.6时,转化率提高20%～30%.     

Cloning and nucleotide sequencing of the membrane-bound L-sorbosone dehydrogenase gene of Acetobacter liquefaciens IFO 12258 and its expression in Gluconobacter oxydans.

Cloning and expression of the gene encoding Acetobacter liquefaciens IFO 12258 membrane-bound L-sorbosone dehydrogenase (SNDH) were studied. A genomic library of A. liquefaciens IFO 12258 was constructed with the mobilizable cosmid vector pVK102 (mob+) in Escherichia coli S17-1 (Tra+). The library was transferred by conjugal mating into Gluconobacter oxydans OX4, a mutant of G. oxydans IFO 3293 that accumulates L-sorbosone in the presence of L-sorbose. The transconjugants were screened for SNDH activity by performing a direct expression assay. One clone harboring plasmid p7A6 converted L-sorbosone to 2-keto-L-gulonic acid (2KGA) more rapidly than its host did and also converted L-sorbose to 2KGA with no accumulation of L-sorbosone. The insert (25 kb) of p7A6 was shortened to a 3.1-kb fragment, in which one open reading frame (1,347 bp) was found and was shown to encode a polypeptide with a molecular weight of 48,222. The SNDH gene was introduced into the 2KGA-producing strain G. oxydans IFO 3293 and its derivatives, which contained membrane-bound L-sorbose dehydrogenase. The cloned SNDH was correctly located in the membrane of the host. The membrane fraction of the clone exhibited almost stoichiometric formation of 2KGA from L-sorbosone and L-sorbose. Resting cells of the clones produced 2KGA very efficiently from L-sorbosone and L-sorbose, but not from D-sorbitol; the conversion yield from L-sorbosone was improved from approximately 25 to 83%, whereas the yield from L-sorbose was increased from 68 to 81%. Under fermentation conditions, cloning did not obviously improve the yield of 2KGA from L-sorbose.     

碳源和氮源对5-酮基-葡萄糖酸生成的影响

氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并进一步氧化成2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和5-酮基-葡萄糖酸(5KGA),其中5KGA在催化剂的作用下能够转化为L(+)-酒石酸。为了提高5-酮基-葡萄糖酸产量,以仅生成5KGA的氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans HGI-1为出发菌株,研究不同碳源(蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、葡萄糖)和有机氮源(酵母浸粉、鱼粉、玉米浆、黄豆饼粉、棉籽饼粉)对5KGA产量的影响。500 mL摇瓶试验结果表明,当葡萄糖浓度为100 g/L时,5KGA产量最高为98.20 g/L;当有机氮源为酵母浸粉、鱼粉和玉米浆,其添加量的蛋白含量为1.60%时,5KGA产量分别为100.20 g/L、109.10 g/L和99.83 g/L,其中,使用鱼粉的5KGA产量最高,使用玉米浆的5KGA产量比酵母浸粉略低。出于经济考虑,文中选择玉米浆作有机氮源,并在5 L发酵罐中进行分批发酵放大试验,5KGA的产量为93.80 g/L,最大生成速率为3.48 g/(L·h),平均生成速率为1.56 g/(L·h)。结果表明,葡萄糖和玉米浆分别为Gluconobacter oxydans HGI-1规模化生产5KGA的最适碳源和氮源,可利用葡萄糖几乎全部(85.93%)转化为5KGA。     

Vc二步发酵伴生菌巨大芽孢杆菌的选育

巨大芽孢杆菌经紫外线诱变,获得2株耐低pH、抗KGA的菌株：Bn,B5。在pH6.7～7．0的发酵培养基中与氧化葡萄糖酸杆菌发酵,Bn和B5的平均糖酸转化率分别提高3.5％,3．3％.在pH6．2的发酵培养基中,平均糖酸转化率提高11．4％,12．3％。在pH6．2和pH7．0含3％KGA的培养基中,2菌提前3～6h到达对数生长期,稳定期延长3～6h.经连续30代转接,特性稳定。     

分泌白细胞介素—2T细胞杂交瘤株的建立

本研究利用T淋巴细胞杂交瘤技术建立了能持续稳定地分泌白细胞介素—2(IL—2)的小鼠T淋巴细胞杂交瘤株,首先用刀豆蛋白A(ConA)活化BALB/C小鼠的脾细胞,然后使其与小鼠胸腺瘤细胞BW5147融合,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法从261个杂交克隆中筛选出至少30个分泌IL—2的T细胞杂交瘤株,对选出的一个杂交瘤细胞株FB4作了进一步研究,该杂交瘤株的染色体平均44(42～47)条,经传代培养、冻存和复苏后仍能持续稳定地分泌IL—2,用含2％小牛血清的DMEM完全培养基大量培养FB4杂交瘤细胞,制得含IL—2的培养上清,再经沉淀和凝胶过滤等步骤制得了部分纯化的IL—2,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)技术检出了IL—2成分,其表观分子量(MW)约28KDa。