氧化葡萄糖酸杆菌SCB329染色体的测定

对氧化葡萄糖酸杆菌(\%Gluconobacter oxydans\%)SCB329的纯培养进行了研究,测定了其生长曲线,确定其对数期为4～27h。获得纯培养的对数期菌体后采用凝胶包埋法制备完整染色体,用脉冲场电泳方法对SCB329的染色体进行了分析,确定其有一条染色体和一个大质粒。染色体的长度在22Mb到35Mb之间。     

新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究 Ⅰ.新组合菌系SCB329-SCB933的生物学特性

采用紫外照射、化学诱变和原生质融合等方法选育到一株性状更优良的突变株SCB329,并与新筛选的一株芽孢杆菌SCB933搭配组成新的组合菌系。产酸小菌SCB329与其亲本菌株氧化葡萄糖酸杆菌性状相似。伴生大菌SCB933属苏芸金芽孢杆菌（B.thuringiensis）。新组合菌系利用L-山梨糖的发酵液提取后经纸层析,元素分析和红外吸收光谱等项鉴定,其发酵产物确系2-酮基-L-古龙酸,对新组合菌系的生物学特性也进行了研究。     

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)SCB329以D－山梨醇为底物培养时可产生微量2－酮基－L－古龙酸;而葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter sp.)SCB110能将D－山梨醇以较高效率转化为L－山梨糖,但不产2－酮基－L－古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等,确定其主要的代谢产物是2－酮基－L－古龙酸。     

酮古龙酸菌醇醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的：从酮古龙酸菌SCB329株中分离山梨糖生物氧化相关酶的基因并进行表达验证。方法：根据酮古龙酸菌SCB329株基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329株基因组中扩增醇醛脱氢酶基因aadh;构建载体pBMP3-aadh并在大肠杆菌中表达,经活性染色、体外转化反应等方法考察表达产物的活性。结果：目的产物能够催化山梨糖、葡萄糖、果糖、木糖等多种含羟基及羰基化合物脱氢,并能将L-山梨糖直接转化为2-酮基-L-古龙酸。结论：从酮古龙酸菌SCB329株中分离到一种醇醛脱氢酶基因,可为该菌株糖酸转化机制的研究提供帮助。     

新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究 Ⅱ.利用L-山梨糖批加技术实现高糖发酵

新组合菌系氧化葡萄糖酸杆菌SCB329-苏芸金芽孢杆菌SCB933能在较长时间内保持高的转化活力且具有极强的抗杂菌污染的特性。在一次投糖分批发酵的基础上,探索在控制溶氧、pH、温度等条件下,分批加入L-山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸新工艺。采用新工艺,既充分利用了菌系的优良特性,又避免了高糖浓度可能对菌系造成的不良影响。L-山梨糖最终浓度达到14%（w/v）,产酸120—135g/l,转化率90％左右,发酵周期40—65h。     

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)SCB3 2 9以D 山梨醇为底物培养时可产生微量 2 酮基 L 古龙酸 ;而葡萄糖酸杆菌 (Gluconobactersp .)SCB1 1 0能将D 山梨醇以较高效率转化为L 山梨糖 ,但不产 2 酮基 L 古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养 ,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等 ,确定其主要的代谢产物是 2 酮基 L 古龙酸。     

混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用

为查明维生素Ｃ二步发酵混合培养中巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌间的关系,通过生长曲线测定、静息细胞实验及摇瓶发酵实验研究了巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产生２－酮基－Ｌ－古龙酸作用的影响;采用超滤分离、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸作用的活性物质进行了分离和纯化。结果表明,大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,大菌胞外液中具有该作用的组分分子     

维生素C二步发酵中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的影响

通过测定氧化葡萄糖酸杆菌转化L－山梨糖中成ZKGA的细胞酶活性、摇瓶发酵及中长变化,研究了Vc:步发酵中巨大茅孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸作用的影响。结果显示：巨大芽孢杆菌胞外液和胞内液均可促进氧化葡萄糖酸杆菌的增殖,主要表现为缩短其中长周期中的延迟期;巨大芽孢杆菌通过所产生的部分生物活性物质增强氧化葡萄糖酸杆菌产酸的细胞酶活性,促进氧化葡萄糖酸杆菌转化L一山梨糖生成2KGA.     

巨大芽孢杆菌在维生素C二步发酵中的作用

巨大芽孢杆菌培养时期不同其上清液对促进氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸能力不同,在稳定期及衰亡初期显著促进氧化葡萄糖酸杆菌生长与产酸.pH、温度可改变上清液对氧化葡萄糖酸杆菌生长与产酸的影响.上清液中含活性物质具有蛋白质的部分性质,对酸、碱、热敏感.     

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329基因组的大小与结构的研究

收集维生素C产生菌氧化葡萄糖酸杆菌GluconobacteroxydansSCB32 9的纯培养对数期的菌体 ,采用凝胶包埋法制备完整染色体 ,用稀有酶切位点的限制性内切酶和脉冲场电泳技术对SCB32 9的基因组进行了分析 ,SpeⅠ (5′ ACTAGT)酶切有 2 4个片段 ,其大小从 1 0kb到32 0kb,用XbaⅠ (5′ TCTAGA)酶切产生 40个片段 ,其大小从 4kb到 2 0 0kb,综合两种限制酶酶切片段长度的总和结果 ,SCB32 9基因组大小为 2 70 0kb,SCB32 9基因组由一条 2 50 0kb的染色体和一个 2 4 5kb的质粒组成。通过用脱氧核糖核酸酶Ⅰ和S1核酸酶处理其基因组后电泳证实SCB32 9的染色体和质粒的拓扑学结构均为环状     

维生素C混合发酵中产酸菌基因文库的构建

在对氧化葡萄糖酸杆菌ＳＣＢ３２９的纯培养方法进行了探索并获得了一定量的纯培养的ＳＣＢ３２９菌体的前提下,用常规方法抽提得到Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　ＳＣＢ３２９染色体ＤＮＡ。选用质粒ｐＫＳ作为载体,该载体具有氨苄抗性以及ｌａｃＺ基因．用限制酶对染色体进行部分消化,将一定范围内的消化片段回收后与载体连接,连接产物转化Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５ａ感受态细胞,利用蓝白斑特性选出重组子构建ＳＣＢ３２９基因组文库。用低熔点琼脂糖将ＳＣＢ３２９菌体包埋起来,对包埋在凝胶块中的细菌     

新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的研究Ⅲ.发酵过程的特征和条件控制

在分析了新组合菌系ＳＣＢ３２９－ＳＣＢ９３３发酵过程特征的基础上,对流加发酵工艺中的种子培养、ｐＨ、溶氧的控制,以及发酵液初始培养基中的Ｌ－山梨糖浓度和流加起始点进行了优化,获得了比分批发酵更为满意的结果：发酵最终总糖达１３％（ｗ／ｖ）左右,发酵周期４０～５０ｈ,产２－酮基－Ｌ－古龙酸达１１５－１３０ｍｇ／ｍｌ,克分子转化率达８８ｍｏｌ％左右。     

VC二步发酵新组合菌系的研究

选用苏云金芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成一新组合菌系 ,其摇瓶发酵转化率较原菌系提高 4 .83% ,且具有耐受高浓度 (10 % )山梨糖的特性。在 4m3 发酵罐中 ,连续 4批发酵平均转化率较对照菌系提高 8.16 % ,周期缩短 2 3.7%。新菌组合系的发酵转化率与玉米浆浓度成正相关性 ,尿素浓度x2 =1.4 5 % (g/ 10 0mL)时 ,转化率达最大。     

Spaceflight‐induced enhancement of 2‐keto‐L‐gulonic acid production by a mixed culture of Ketogulonigenium vulgare and Bacillus thuringiensis

Two bacterial strains used for industrial production of 2‐keto‐L‐gulonic acid (2‐KLG), Ketogulonigenium vulgare 2 and Bacillus thuringiensis 1514, were loaded onto the spacecraft Shenzhou VII and exposed to space conditions for 68 h in an attempt to increase their fermentation productivities of 2‐KLG. An optimal combination of mutants B. thuringiensis 320 and K. vulgare 2194 (KB2194‐320) was identified by systematically screening the pH and 2‐KLG production of 16 000 colonies. Compared with the coculture of parent strains, the conversion rate of L‐sorbose to 2‐KLG by KB2194‐320 in shake flask fermentation was increased significantly from 82·7% to 95·0%. Furthermore, a conversion rate of 94·5% and 2‐KLG productivity of 1·88 g l^?1 h^?1 were achieved with KB2194‐320 in industrial‐scale fermentation (260 m³ fermentor). An observed increase in cell number of K2194 (increased by 47·8%) during the exponential phase and decrease in 2‐KLG reductase activity (decreased by 46·0%) were assumed to explain the enhanced 2‐KLG production. The results suggested that the mutants KB2194‐320 could be ideal substitutes for the currently employed strains in the 2‐KLG fermentation process and demonstrated the feasibility of using spaceflight to breed high‐yielding 2‐KLG‐producing strains for vitamin C production.

Significance and Impact of the Study

KB2194‐320, a combination of two bacterial strains bred by spaceflight mutation, exhibited significantly improved 2‐KLG productivity and hence could potentially increase the efficiency and reduce the cost of vitamin C production by the two‐step fermentation process. In addition, a new pH indicator method was applied for rational screening of K2, which dramatically improved the efficiency of screening.