荧光共振能量转移效率的实时定量测量

荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用,与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展,FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法,仅需使用一组滤光片和测量一个比值,利用供体和受体的发射谱肖除光谱间的串扰。该方法简单快速,可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离,尤其适用于基于GFP的供体－受体对。     

珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研究和应用

绿色荧光蛋白作为标记蛋白和报告蛋白在生物学研究中应用越来越广。但在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)等技术中存在一些缺陷,需要更大波长范围的荧光蛋白。最近研究发现了多种来源于珊瑚和海葵的红荧光蛋白,这些长波长的荧光蛋白对绿色荧光蛋白是一种很好的代替和补充,可以实现细胞内多荧光标记,提供更理想的FRET荧光对。经随机突变和定点突变等方法改建获得的红荧光蛋白变种显示出更高的荧光强度,成熟时间也更短。目前应用较多的是来源于香菇珊瑚(Discosomasp.)的红荧光蛋白DsRed。     

一种改进的荧光共振能量转移方法分析同质二聚体内蛋白质-蛋白质相互作用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技术日益广泛的应用于检测活细胞中分子内和分子间的相互作用. 由于FRET仅发生于相互作用的供体和受体,即供体-受体复合物之间,所以检测的FRET信号必须经标准化处理以去除供体受体比例和浓度的影响然后才能够进行FRET的比较研究. 由于供体和受体的比例相同,分子内FRET的检测较为简单;而分子间FRET的检测存在更多的不确定因素,导致现有的方法很难精确定量.根据1类特殊的分子间相互作用,同质二聚体的独特特征,推导出供体 受体复合物的含量,进而开发了1种同质二聚体分子间FRET的精确定量的方法,以1种同质二聚体,雌激素受体α(estrogen receptor alpha, ERα)为供体和受体对,通过和其它的方法比较,证实了该方法用于FRET检测可获得更可靠的结果.     

多聚甲醛固定对荧光蛋白分子间FRET效率的影响

目的：研究多聚甲醛固定对利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)检测细胞中蛋白质相互作用的影响,解决运动能力较强的细胞中FRET效率检测的问题。方法：选用两个已知能够相互作用的蛋白分子TRA和TRB,将荧光蛋白ECFP和EYFP的编码基因通过融合PCR分别标记在其C端;将两个融合基因共转染靶细胞,一组细胞经低浓度（0.5%）多聚甲醛短时（0.5~1h）固定,另一组不固定,利用激光共聚焦扫描显微镜检测两个融合蛋白之间的FRET效率,比较其在两组细胞之间的差异情况。结果：经过统计学分析,在活细胞和经低浓度多聚甲醛短时间固定的细胞中,ECFP与EYFP之间的FRET效率没有显著差异。结论：低浓度短时间的多聚甲醛固定对于荧光蛋白分子之间的相互作用没有显著的影响,因此对于运动能力过强的细胞可以固定后再进行FRET检测。     

抗砷细胞荧光染色后的激光共聚焦显微镜检测

目的:应用激光共聚焦显微镜检测活细胞内荧光物质含量.方法:传代培养长期低剂量砷诱导的抗砷细胞,用荧光染料Rhodamine-123对细胞染色30min,实验组与维拉帕米(Verapamil)共同孵育,对照组为单加Rhodamine-123的抗砷细胞.应用激光共聚焦显微镜采集Rhodamine-123的荧光图像动态序列,并且记录不同时间段的细胞内荧光强度.结果:实验组细胞染色12h,24h,36h,48h,60h后,荧光强度依次为(51.567±0.7572)、(46.533±0.7095)、(39.557±0.601)、(38.6±0.6245)和(38.505±0.718),明显高于同时间段对照组的荧光强度,差异均有显著性(P＜0.01).结论:应用激光共聚焦显微成像技术能进行活细胞水平荧光物质实时定量检测.     

对同一细胞内DNA、RNA和蛋白含量相关测定的显微荧光光度法

用荧光染料DAPI、PyroninY和FITC分别染同一细胞内DNA、RNA和蛋白.在紫外光、绿光和兰光顺序激发后,用MPVⅡ显微荧光光度计测量反映单个细胞内DNA、RNA和蛋白含量的荧光强度.根据荧光发射光谱分析,每种染料荧光之间的干扰是可以忽略的.测量结果与FCM获得的结果是一致的.显微荧光光度术对单个细胞多参数相关测量的优点是简单、便宜,并可用于对活细胞获得形态学和定量细胞化学的组合信息.     

单个活细胞中生物分子动态行为的FRET实时检测

分别采用两种不同绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)突变体作为荧光共振能量转移(fluo-rescence resonance energy transfer,FRET)对的供体和受体,并利用分子生物学技术将供体和受体分子分别与特定的生物分子融合,这种技术已经成为在单个活细胞中实时长时间检测蛋白质间的动态相互作用的主要技术。主要介绍了基于GFPs的FRET技术在单个活细胞中实时长时间研究生物分子动态行为的应用。     

基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

基于C6流式细胞仪平台应用FRET技术在活细胞中研究蛋白质相互作用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)显微镜技术被广泛应用于在活细胞中研究蛋白质相互作用。随着流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)的发展与应用,FACS-FRET技术不但可以检测活细胞中蛋白质相互作用,还可以进行定量统计分析。由于流式细胞仪价格昂贵、FRET技术对荧光基团发光光谱的特殊要求等原因,目前为止FACS-FRET技术仅仅被应用到一些特殊的科学研究。为了解决这些问题,构建了一对新的FRET荧光基团EGFP-m Cherry,并且在小型流式细胞仪C6上检测了EGFP-m Cherry融合蛋白的FRET信号,最后使用已明确有相互作用关系的p53蛋白和MDM2蛋白做验证,证明了所构建的EGFPm Cherry可以作为检测FRET信号的荧光基团。不仅促进了FACS-FRET技术的发展,还为人类疾病治疗的药物作用靶点研究提供了有利的研究手段。     

生物大分子相互作用检测技术新进展———三色荧光级联荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET),是指能量从一种受激发的荧光基团(fluorophore)以非辐射的方式转移到另一种荧光基团的物理现象.FRET的能量转移效率是两个荧光基团间距离的函数,并对此距离十分敏感,它的有效响应距离一般在1～10nm之间,因而可被用于测定原子间及分子间的距离.这一特点使FRET技术在大分子构象变化、大分子之间相互作用、细胞信号通路等研究中发挥重要作用,成为生物医学研究中的重要方法.但细胞内的生物学过程常常涉及多于两个的大分子间相互作用,二色荧光基团的FRET技术不能满足这种生物学研究的需求.最近,两个研究小组在这方面取得突破,建立了分别基于共聚焦显微镜和流式细胞仪的三色荧光级联FRET技术.这一技术的出现将会极大地促进生物学及相关研究领域的发展.