兔多杀性巴氏杆菌C51-3株黏附蛋白的表达、纯化及其抗原性检测

应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。     

基于denovo测序分析Bt菌株S3299-1基因组特征

分离菌株S3299-1是从海南省吊罗山热带雨林自然保护区土壤中分离保存的对小菜蛾具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌,但目前尚未明确该菌株的杀虫蛋白基因。本研究主要采用Illumina Hiseq2000二代测序平台对分离菌株S3299-1基因组进行Survey测序以挖掘该菌株的杀虫蛋白基因。研究结果表明:S3299-1基因组的大小为5 498 939 bp,GC含量为34.94%,Scaffold 176个,ORF 5 755个,将Scaffold进行拼接得到4个复制子,即一个大小为4 338 kb的拟核和3个不同的质粒(S3299-1p01,S3299-1p02,S3299-1p03),并预测可能含有的毒蛋白编码基因有25个。通过草图测序以及生物信息学分析手段获得S3299-1的框架图,预测该菌株可能含有的杀虫蛋白基因以及为今后研究该菌株的杀虫蛋白功能提供基础。     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌224 yugS基因缺失突变株

从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉素抗性平板上挑取转化子,通过对基因组的PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定转化子yugS156为yugS基因缺失突变株。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子的克隆、鉴定及其应用

利用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)从短小芽孢杆菌基因组中扩增到碱性蛋白酶基因编码区上游的启动子片段。对该片段的序列测定和分析表明, 此片段长797 bp, 但与基因表达有关的序列长约390 bp。对启动子片段进行不同长度的缺失突变, 以获得最小的基因启动子片段, 结果表明, 该基因起始密码子上游约160 bp的DNA片段就可以启动基因的表达。将含有该片段的碱性蛋白酶基因WApQ3插入大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体pSUGV4中, 构建了碱性蛋白酶基因表达质粒pSUBpWApQ3。将该质粒分别转入枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中表达, 可在胞外检测到碱性蛋白酶活性, 最高酶活分别为466.5 U/mL和3060 U/mL。     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。     

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为 CMV-BHI外壳蛋白基因在香蕉中表达打下了基础     

苏云金杆菌辅助蛋白P19对杀虫晶体蛋白Cry11Aa表达的影响

苏云金杆菌以色列亚种的p19基因、cry11Aa基因和p20基因位于同一操纵子上,据推测辅助蛋白P19可能与Cry11Aa蛋白的晶体化相关。本研究利用穿梭载体pHT3101构建了两个重组质粒pHcy1和pHcy3,两质粒均携带cry11Aa基因,但后者完全缺失了cry11Aa基因上游的p19基因。将重组质粒电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株4Q7中进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明在4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy3)中均能检测到正常表达的Cry11Aa蛋白,但单位体积培养液的Cry11Aa蛋白在辅助蛋白P19存在时的表达量明显高于其单独表达的表达量;透射电镜观察显示两菌株中的Cry11Aa蛋白形成了大小相近、形状相似的双梯形晶体;另外,生物测定结果表明重组菌株4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy3)对三龄致倦库蚊的杀虫活性没有显著性差异。该现象说明辅助蛋白P19的缺失对Cry11Aa蛋白的晶体形成和杀蚊活性没有影响,但P19作为分子伴侣在一定程度上帮助提高了Cry11Aa蛋白的表达水平。     

青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(orf 7),克隆到pMD18-T载体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR-2332株的同源性为100%,表明orf 7 是PRRSV基因组内很保守的序列;将orf 7亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建成重组质粒pGEX-KGN,用pGEX-KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和 Western-blot分析表明克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础.     

胰蛋白酶抑制剂基因siRNA表达体系的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了siRNA表达体系。利用农杆菌介导法将带有pBIKSTI3的菌株转化大豆,从2棵再生植株中得到2 100bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生。     

植物乳杆菌KLDS1.0728质粒p141的分子分析

对分离自植物乳杆菌KLDS1.0728的质粒p141进行了全序列测定,结果显示,该质粒全长为3597bp,平均G+Cmol%值为38%,并利用DNAMAN6.0软件得到该质粒限制性内切酶图谱。经NCBI网站ORFFinder软件分析确定其编码序列即ORF为15个,通过与公共数据库比对,发现可以识别功能的ORF有2个,其中包括质粒复制所必需的rep基因,p141的rep基因与已知序列的植物乳杆菌WCFS1内源质粒pWCFS101以及植物乳杆菌内源质粒pM4的复制蛋白基因相似性高达91%。根据rep基因的相似性比较,判断p141的复制模式归属于RCR模式的GroupIII组,即pC194家族。另外,还发现质粒p141中存在mob基因,表明该质粒具有水平转移能力。但没有发现Tn4430转座子以及转座酶基因topl和topA,所以可以判断该质粒的基因比较稳定。此外,还发现该质粒序列中存在一定的与质粒复制和转移调控以及蛋白质表达等有关的重复序列,其对调控质粒的拷贝数有一定意义。     

广西巴马小型猪小RNA启动子U6和7SK的克隆及功能验证

为了探讨巴马小型猪启动子U6和7SK的功能以及为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础,文章克隆并分析了siRNA启动子U6和7SK,并分别连接pMD18-shEGFP载体,分别与PEGFP-N1共转猪肾细胞,进行RNAi实验。以pMD18-hU6-shEGFP为阳性对照,无启动子的pMD18-shEGFP载体为阴性对照,单独转染PEGFP-N1为第一组空白对照,以ddH2O替代质粒为第二组空白对照组,验证这两种启动子在猪细胞中的功能。结果表明:广西巴马小型猪RNA聚合酶III型siRNA启动子U6和7SK的序列全长分别为553 bp和437bp。成功构建了pMD18-pU6-shEGFP和pMD18-p7SK-shEGFP干扰载体,转染猪源PK-15细胞,证明U6以及7SK两个启动子具有较高的siRNA表达活性,可以用于α-1,3半乳糖转移酶等猪源基因的沉默实验。     

苏云金杆菌辅助蛋白基因p19和orf1-orf2对杀虫晶体蛋白Cyt1 Aa表达的影响(英文)

为检测苏云金杆菌辅助蛋白P19和ORF1 ORF2对杀虫晶体蛋白Cyt1Aa表达的影响 ,构建了 5个重组表达质粒。 5个质粒都含有cyt1Aa基因 ,但pT1只含有cyt1Aa基因 ,pT2同时含有p19基因 ,pT3同时含有orf1 orf2串联基因 ,pT4同时含有p19基因和p2 0基因 ,pT5同时含有orf1 orf2串联基因和p2 0基因。将这 5个表达质粒和质粒pWF4 5电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型 4Q7中 ,分别获得转化菌株Bt T1、Bt T2、Bt T3、Bt T4、Bt T5和Bt WF4 5。SDS PAGE结果显示 ,菌株Bt T1、Bt T2和Bt T3只产生少量的 2 7kDCyt1Aa蛋白 ,而且部分降解为大约 2 4kD的蛋白。而Bt T4和Bt T5能产生大量的Cyt1Aa蛋白 ,但Bt T4和Bt T5的Cyt1Aa蛋白产量都明显少于Bt WF4 5。电镜观察和生物测定结果表明Bt T4和Bt T5与Bt WF4 5的晶体大小和杀蚊毒力没有显著性差异。研究表明P19和ORF1 ORF2对Cyt1Aa蛋白的合成显示可能有抑制作用。     

人apoA-I分泌型表达调控细胞模型构建

分别从pMD18-T质粒和人基因组DNA扩增出人apoA-I CDS区序列和apoA-I启动子(702bp片段),与pEGFP-N1重组,构成受apoA-I启动子调控的pEGFP-N1质粒和融合蛋白表达质粒,分别转染人肝癌HepG2细胞,以绿色荧光为标志筛选稳定转染系列克隆。用RT-PCR、荧光显微镜、免疫荧光术等鉴定其中一个克隆融合蛋白的表达;分别以胰岛素和葡萄糖刺激物鉴定该克隆的外源apoA-I启动子调控。结果表明:人apoA-I分泌型表达调控肝细胞模型初步建成。     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。     

L1-ORF2不同片段对报告基因表达产生不同影响

长散布重复序列-1(Line-1, L1)是重要的人类基因组成分, 完整的L1有6 kb, 在基因组中存在的L1多数是不完整序列, 有必要研究L1片段对基因表达的调控作用。PCR扩增L1第二读码框(L1-ORF2)不同位置的 280 bp片段, 共7段, 同向8串联按正、反方向分别插入pEGFP质粒GFP基因下游, 观察插入序列对GFP报告基因表达的影响。构建的质粒瞬时转染HeLa细胞, 经荧光显微镜和Northern检测, 不同片段对转录量和终止影响不同。7个片段正序对GFP报告基因的抑制均高于其反序, 在正序串联表达载体p280-1*8和p280-9*8的GFP基因转录量超过其他280正序插入片段, 在反序串联表达载体p280-1*8as和p280-9*8as的GFP基因转录量超过其他280反序片段。280-1*8、280-9*8、280-1*8as和280-9*8as属于转录终止性序列。Alu在基因组的多数区段与L1分布呈反比, Alu正、反序均对GFP表达有抑制作用, 但反序抑制作用高于正序, Alu正序属于转录延伸性序列。280 bp片段反序插入的所有质粒荧光阳性细胞均高于正序插入质粒。经碱基分析, L1-ORF2各段均存在A碱基含量多, T碱基含量少的现象, 这可能是其正、反序对基因表达影响不同的原因。     

A型魏氏梭菌α毒素氨基端plc基因的生物学活性探究

为了探究α毒素氨基端及其生物学功能的关系,本研究利用PCR技术克隆了魏氏梭菌α毒素氨基端基因PLC1-250,构建了含PLC1-250基因重组质粒的BL21(DE3)(p N-PLC1-250)重组表达菌株。根据序列分析和酶切鉴定的结果,证实了重组质粒p N-PLC1-250含有PLC1-250基因,且其开放阅读框架和基因序列均正确。经过SDS-PAGE分析,结果表明PLC1-250蛋白表达量约占菌体总蛋白相对含量的18.76%。对其生物学活性的研究表明,PLC1-250蛋白与α毒素一样具有磷脂酶C活性。研究为进一步揭示α毒素的分子作用机制提供了有力的支持。     

NtSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生

根据枯斑三生烟SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计一对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,扩增目的基因(约473bp)片段。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL的内含子右侧,再经NotⅠ酶切回收约3443bp的目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段反向序列的植物表达载体pART27-skp1a,其转录产物能减弱目的基因的表达。将pART27-skp1a质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

喜盐芽孢杆菌D8基因文库的构建及甘氨酸甜菜碱转运蛋白betH基因的筛选

喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)D8是一株产生芽孢的革兰氏阳性中度嗜盐菌,能够耐受2 5 %NaCl。以其总DNASau3AI部分酶切的片段为供体、pUC18为载体,构建了该菌株的基因文库,共获得约90 0 0个重组质粒。通过菌落原位杂交、菌落PCR检测及DNA序列测定,从该文库中筛选到含有完整的甘氨酸甜菜碱次级转运系统基因的重组质粒,将此基因命名为betH基因。序列分析发现,betH基因的大小为15 15bp ,编码由5 0 5个氨基酸组成的BetH蛋白,分子量为5 6 1kD。经蛋白疏水性分析,推测为含有12个跨膜区的跨膜蛋白,与Oceanobacillusiheyensis甘氨酸甜菜碱转运蛋白、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)OpuD、楚氏喜盐芽孢杆菌(Halobacillustrueperi)BetH、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)BetL、嗜盐海球菌(Marinococcushalophilus)BetM和耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)甘氨酸甜菜碱转运蛋白的氨基酸同源性分别为6 4 %、5 1%、4 9%、4 8%、4 3%和4 4 %。