宝成生物工程(大连)有限公司

<正>什么是good science? Good science也许被低估了。它可能不是那么华丽炫目,但是它带来革新。它开启了新的可能性。它告知,它启发,它创造。快来加入Takara和Clontech,一次一个实验,一起传颂这些生命科学研究的故事,是它们把世界变得更美好。科学领域,每个决定都有着深远的影响…每个时刻都是一个机遇,把一个实验最深的意义挖掘出来。决定很重要,无论是实验设计还是数据分析。这是我们通过经验确认的;我们是科     

that's GOOD science!

<正>什么是good science?Good science也许被低估了。它可能不是那么华丽炫目,但是它带来革新。它开启了新的可能性。它告知,它启发,它创造。快来加入Takara和Clontech,一次一个实验,一起传颂这些生命科学研究的故事,是它们把世界变得更美好。科学领域,每个决定都有着深远的影响…每个时刻都是一个机遇,把一个实验最深的意义挖掘出来。决定很重要,无论是实验设计还是数据分析。这是我们通过经验确认的;我们是科学家。     

“可能还会有第2次、第3次收购”——访TAKARA BIO加藤郁之进社长

——Clontech业务收购顺利吗7加藤实际情况是,直到最后．还不能确定能否完成收购。关于金额到底双方能达成什么样的协议．直到最后都没有搞清楚。此次的收购刚开始是TAKARABIO公司与一家美国企业的联合收购计划。但中途该美国公司退出．最终由TAKARABIO公司单独进行了收购。TAKARABIO公司的代理人大和证券SMBC和BD公司的代理人美国Goldman Sachs公司从2004年12月开始经过总计3次谈判．直到2005年7月1日才达成正式协议．比当初预计的时间整整晚了4个月。     

酵母双杂交筛选与甲状旁腺素1型受体相互作用的蛋白

目的:采用Clontech公司第3套酵母双杂交系统,筛选与甲状旁腺素1型受体(PTH1R)相互作用的蛋白。方法:将全长PTH1R基因克隆到载体pGBKT7作为诱饵,用LiAc介导将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PTH1R和人肾cDNA文库质粒转化到酵母菌AH109中,检测Mel1报告基因的表达,并进行相互作用的验证。结果:测序和相互作用验证结果表明SNAPIN在酵母系统中能特异地与PTH1R相互作用;根据对SNAPIN基因的功能分析,其可能与细胞内钙稳态的调控有关。结论:为进一步研究PTH1R促进骨肉瘤进展的机制提供了一定的线索。     

芽孢杆菌Bacillus sp. S-1壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

从连云港海滩晒虾蟹壳的泥土里筛选出一株产壳聚糖酶能力较高的菌株S-1,根据其形态特征、生理生化以及16S rDNA鉴定,初步认定该菌为芽孢杆菌属（Bacillus）。利用NCBI数据库中已经报道的Bacillus壳聚糖酶序列设计兼并引物,以菌株Bacillus sp. S-1的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR）,克隆到壳聚糖酶基因的部分序列;利用Clontech公司Universal GenomeWalker试剂盒构建该菌株的基因组步移文库,根据已测定的序列信息设计特异性引物,结合两步法PCR技术分别克隆两端未知序列,拼接获得壳聚糖酶基因的全长序列（该基因全长1362 bp编码453个氨基酸,注册号：EU924147）,并对该序列进行了生物信息学方面的分析。     

脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点活性的研究

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus ,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site ,IRES)已被广泛运用于蛋白的表达中,如应用于Clontech 公司推出的pIRES2 质粒对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。但是由于对EMCV的IRES了解还不够深入而在利用EMCV的IRES进行基因表达过程中经常会遇到问题,很有必要对其进行更深入的研究。以红绿色荧光蛋白基因作为报告基因,通过分子克隆、荧光显微镜、荧光分光光度计、Western blot等分子细胞生物学手段,对EMCV的IRES末端序列与其活性的关系进行了深入研究。研究发现EMCV的IRES末端序列对其IRES的活性影响极大,而人们常用的报告基因EGFP本身也可能存在IRES。     

酵母双杂交常用菌株AH109半乳糖苷酶检测实验呈阳性

α 及 β galactosidase(半乳糖苷酶 )是酵母双杂交实验中用来确定阳性相互作用的重要筛选标记 .理论上来说 ,只有同时携带有BD及AD载体 ,且BD载体上的诱饵蛋白 (Bait)与AD载体上的靶蛋白有相互作用时 ,才能激活酵母报告基因表达半乳糖苷酶 ,从而在LacZ实验中见到蓝斑 .另外 ,如果BD载体上的诱饵蛋白具自激活作用 ,那么只带有这一种质粒的酵母也会检测到半乳糖苷酶的活性 .所以 ,未转入任何质粒的 ,可用于酵母双杂交的菌株应该是检测不到半乳糖苷酶活性的 .但我们发现 ,本实验室未转任何质粒的AH10 9菌株 (2 0 0 2年购自Clontech ,Lo…     

渗透胁迫相关基因高通量筛选技术体系的建立

随着功能基因组学的发展,在基因组水平上获得了大量渗透胁迫相关基因。农杆菌介导的超量表达是筛选和鉴定这些基因功能最为常用的技术。以植物表达载体pBI121为基础,在不改变其氨基酸序列的基础上通过定点突变消除了其上与质粒复制和稳定性有关的trfA基因（X00713）内部的SfiI酶切位点,并在表达单元CaMV35s启动子和NOS终止子之间引入了SfiIA和SfiIB位点,改造成通用植物表达载体卡盒pBHT-5。该载体卡盒可直接用于连接Clontech SMARTTM技术构建的cDNA文库,提高了大规模构建cDNA文库基因植物表达载体的工作效率。为高通量的筛选与鉴定基因功能,从大量的渗透胁迫相关基因中筛选出具有独立知识产权的、对植物抗渗透胁迫起重要作用的新基因奠定了坚实的基础。     

原生动物八肋游仆虫cDNA文库的构建

细胞内蛋白质合成过程是一个由多种蛋白质相互作用参与调节的开放系统,形成了复杂的mRNA代谢和蛋白质翻译为核心的基因表达调控的网络和信号转导途径。【目的】为了获得更多参与调节蛋白质合成终止过程的蛋白质种类和功能信息,进一步了解其中的网络和信号转导途径,本研究构建了原生动物八肋游仆虫的cDNA文库。【方法】构建过程严格遵循Clontech公司的BD MatchmakerTM Library ConstructionScreening kit提供的方案进行文库构建和筛选.【结果】首次得到了可用于筛选功能基因的原生动物纤毛虫的cDNA文库,文库滴度为2.437×107cfu/mL。利用第二类肽链释放因子为诱饵,筛选得到了一些可能与之相互作用的蛋白质,其中包括一个可能编码RNA解旋酶的基因序列。该文库为进一步筛选和研究八肋游仆虫功能基因提供了便利的平台。     

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡蛋白相互作用的研究

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2,IAP3)相互作用的结果。使用Clontech公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达“诱饵”蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达“猎物”蛋白,在低严谨犁筛选培养基上均得到阳性克隆。这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2。SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素一蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物。     

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡蛋白相互作用的研究

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2, IAP3)相互作用的结果.使用Clontech 公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达"诱饵"蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达"猎物"蛋白,在低严谨型筛选培养基上均得到阳性克隆.这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2.SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素-蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物.     

应用酵母双杂交技术寻找与GGNBP相互作用的蛋白质

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是20个世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,其不育原因是由于其胚胎期原始生殖细胞的数目低于正常。FancL(也叫Pog)的缺失是引起gcd突变小鼠的原因,FancL基因缺失后可能影响了小鼠胚胎期原始生殖细胞的增殖／存活和成年期小鼠精母细胞的减数分裂。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,GGN1和GGN2又与一种新的蛋白质GGNBP特异作用。但GGNBP蛋白的功能还不清楚。为了研究GGNBP的功能以及揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第3套酵母双杂交系统,以GGNBP为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白质基因,发现了一个主要在睾丸中表达的新的基因,其编码的蛋白质产物在酵母系统中与GGNBP特异作用。     

中华大蟾蜍精巢组织全长cDNA文库的构建及泛素延伸蛋白基因Bg-ubi52的获得

运用SMART技术构建了中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)精巢全长cDNA文库。提取中华大蟾蜍精巢总RNA,用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得全长cDNA双链;经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,500bp以上的片段与λTriplEx2载体连接并包装,建成原始文库。经鉴定,原始文库滴度为2.21×106pfu/ml,重组率为91%;文库扩增后的滴度为2.94×109pfu/ml,重组率为93.7%。插入片段大小分布于0.4~2.0kb之间,平均长度约为1.0kb,说明已构建文库质量较高,为进一步筛选、克隆精巢特异表达基因奠定了基础。从该文库中克隆到了泛素延伸蛋白基因,全长561bp,包含完整的5′和3′非编码区,编码128个氨基酸,即泛素的76个氨基酸后融合了52个氨基酸的核糖体L40蛋白。     

中国长白山乌苏里蝮蛇金属蛋白酶解整合蛋白Ussurin基因克隆和序列分析

采用Clontech链转换建库试剂盒 ,建立了中国长白山乌苏里蝮蛇毒腺cDNA文库 ,从中克隆了金属蛋白酶 解整合蛋白Ussurin ,并进行了序列分析。结果显示 ,Ussurin开框读码序列由 14 34bp组成 ,编码 4 78个氨基酸。由核苷酸顺序推导的氨基酸序列可以看出 ,Ussurin最初的翻译产物是酶原前体 ;依次含有 18氨基酸组成的信号肽 ,171氨基酸组成的酶原区和由 2 89氨基酸组成的Ussurin(2 0 0氨基酸组成的金属蛋白酶结构域、16氨基酸组成的间隔区和 73氨基酸组成的解整合蛋白结构域 )。Ussurin的金属蛋白酶结构域含有 3对二硫键 ;解整合蛋白结构域含有 6对二硫键和特征性RGD(精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 )结构。其基因序列和结构域组成与GenBank中蛇毒金属蛋白酶 解整合蛋白呈现高度同源性属于P Ⅱ。氨基酸序列blast比对发现 ,酶原区和解整链蛋白结构域呈现极高的同源性 ,而金属蛋白酶结构域却出现了极高的变异 ,推测这些变异结构区是为了适应不同的底物、不同受体或同一受体的不同结构域     

GGN3与GGNBP2的相互作用及作用区域确定

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是上世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,FancL(也叫Pog)的缺失是产生god突变小鼠的原因。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物中的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,而GGN1和GGN3蛋白的功能还不清楚。为了研究GGN3的功能,揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第三套酵母双杂交系统以GGN3为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白分子。发现了一个精子生成期间在睾丸中特异性高表达的基因Ggnbp2,免疫共沉淀分析表明,Ggnbp2编码的蛋白质产物GGNBP2在哺乳动物细胞中与GGN3特异相互作用。通过构建突变体,确定了GGNBP2蛋白与GGN3相互作用的区域。以上结果为揭示GGN3和GGNBP2在生殖发育中的功能、丰富生殖细胞发育的蛋白调控网络及其调控规律奠定了一定的基础。     

中国长白山乌苏里蝮蛇金属蛋白酶解整合蛋白Ussurin基因克隆和序列分析

采用Clontech链转换建库试剂盒,建立了中国长白山乌苏里蝮蛇毒腺cDNA文库,从中克隆了金属蛋白酶/解整合蛋白Ussurin,并进行了序列分析。结果显示,Ussurin开框读码序列由1434bp组成,编码478个氨基酸。由核苷酸顺序推导的氨基酸序列可以看出,Ussurin最初的翻译产物是酶原前体;依次含有18氨基酸组成的信号肽,171氨基酸组成的酶原区和由289氨基酸组成的Ussurin（200氨基酸组成的金属蛋白酶结构域、16氨基酸组成的间隔区和73氨基酸组成的解整合蛋白结构域）。Ussurin的金属蛋白酶结构域含有3对二硫键;解整合蛋白结构域含有6对二硫键和特征性RGD(精氨酸甘氨酸天冬氨酸)结构。其基因序列和结构域组成与GenBank中蛇毒金属蛋白酶/解整合蛋白呈现高度同源性属于P-Ⅱ。氨基酸序列blast比对发现,酶原区和解整链蛋白结构域呈现极高的同源性,而金属蛋白酶结构域却出现了极高的变异,推测这些变异结构区是为了适应不同的底物、不同受体或同一受体的不同结构域。     

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)cDNA文库构建及功能基因筛选

采用Qiagen公司的植物总RNA提取技术、Clontech公司的CreatorTM技术平台以及SMARTTM技术进行cDNA文库构建.从杜氏藻中提取出了高质量的总RNA,通过PowerScript反转录酶反转录杜氏藻的总RNA,采用LD-PCR、酶处理等方法对cDNA进行等比例扩增、纯化,同时使用CHROMA SPIN-400柱子将cDNA分段化,最后将长片段连入pDNR-LIB质粒,1.5 kV,25 μ F电转化大肠杆菌JM109,得到含1.5×106个克隆子的原始文库,滴度为1.5×106cfu ml-1.结合酶切和PCR,对该文库的质量进行了鉴定和统计,文库的平均片段插入长度为1.5kb.采用烯醇酶和UDP葡萄糖脱氢酶的EST作为同源探针,对文库中的功能基因进行筛选,并采用放射性原位杂交法,对扩增文库进行了初筛和复筛,得到了含这两条基因全编码序列的cDNA,烯醇酶为1.8kb,UDP葡萄糖脱氢酶为1.9kb,为今后对该种进行大规模功能基因组学研究奠定基础.     

基于模板转换的微量RNA测序建库方案探索

目的:建立一套简便、对RNA样本起始量要求很低的RNA测序建库方法,在此基础上引入分子条形码技术,从而使RNA-seq的数据所反映的表达丰度更加客观真实。方法:将微量RNA用RNaseⅢ片段化后,利用反转录酶的反转录活性、模板转换活性以及DNA依赖的DNA聚合酶活性,一步实现从RNA到cDNA文库的反应,再通过PCR扩增获得适合测序仪的测序文库,通过测序分析验证建库效果,最后采用荧光定量PCR法测定部分基因的表达量以验证测序结果,同时比较分子条形码的引入对表达量分析的影响。结果:通过电泳观察和测序结果分析,选择Clontech公司的SMARTscribe,反转录和模板转换反应温度设为50℃,反转录完成后经AMPure Beads纯化再经PCR扩增得到测序文库,电泳检测文库DNA长度和浓度符合测序要求。比较发现,用分子条形码建库的测序结果能够更加真实地反应基因的实际表达量。结论:初步建立了针对10 ng RNA样品的RNA-seq建库技术,并在建库方案中加入分子条形码使其测序结果更加真实地反映基因表达量。该技术未来可适用于微量RNA样品的高通量测序。     

近年生命科学的研究热点（1992—1994年）

本文拟对１９９２年一氧化氮、１９９３年抗癌基因Ｐ５３和１９９４年ＤＮＡ修复酶等３个年度分子（即美国《科学》杂志每年年末由该杂志主编主笔评述当年科学界的研究热点）和有关生命科学的亚研究热点及其研究进展作一简略介绍。     

古巴的生物技术

古巴的生物技术产品不久将与旅游、糖业产品和雪茄竞争 ,作为出口收益的主要“发动机”和合资项目的“催化剂”。为达到此目的 ,古巴于 2 0 0 0年 5月在哈瓦那召开题为“2 0 0 0年卫生科学技术与生物技术会议”。这次会议得到古巴公共卫生部、世界卫生组织、泛美卫生组织、古巴外国投资与合作部和古巴科学院的大力支持和资助。会议的目的在于展示古巴科学和生物技术的创新成就 ,展现一系列可作为国际合作的产品和联合研究项目。与会者还收到一份古巴药物和生物技术产品的目录。其中包括一种抗脑炎疫苗、一种乙型肝炎疫苗和一种免疫抑制剂。…