伴刀豆蛋白A促进培养的静止软骨细胞分化

本文观察了Ｃｏｎ Ａ对培养软骨细胞的分化影响，结果证实了Ｃｏｎ Ａ对培养的静止软骨细胞高分子硫酸化ＰＧ，ＡＫＰａｓｅ，维生素Ｄ１受体的合成及细胞外基质＾４５Ｃａ摄取和沉积的钙含量具有明显的促进作用，显示了Ｃｏｎ Ａ具有特异地促进软骨细胞成熟化和终末分化的生物学作用。Ｃｏｎ Ａ的这一作用可由ＭｅＭａｎ完全解除，并有明显的凝集素特异性。     

中国长白山乌苏里蝮蛇金属蛋白酶解整合蛋白Ussurin基因克隆和序列分析

采用Clontech链转换建库试剂盒,建立了中国长白山乌苏里蝮蛇毒腺cDNA文库,从中克隆了金属蛋白酶/解整合蛋白Ussurin,并进行了序列分析。结果显示,Ussurin开框读码序列由1434bp组成,编码478个氨基酸。由核苷酸顺序推导的氨基酸序列可以看出,Ussurin最初的翻译产物是酶原前体;依次含有18氨基酸组成的信号肽,171氨基酸组成的酶原区和由289氨基酸组成的Ussurin（200氨基酸组成的金属蛋白酶结构域、16氨基酸组成的间隔区和73氨基酸组成的解整合蛋白结构域）。Ussurin的金属蛋白酶结构域含有3对二硫键;解整合蛋白结构域含有6对二硫键和特征性RGD(精氨酸甘氨酸天冬氨酸)结构。其基因序列和结构域组成与GenBank中蛇毒金属蛋白酶/解整合蛋白呈现高度同源性属于P-Ⅱ。氨基酸序列blast比对发现,酶原区和解整链蛋白结构域呈现极高的同源性,而金属蛋白酶结构域却出现了极高的变异,推测这些变异结构区是为了适应不同的底物、不同受体或同一受体的不同结构域。     

一种融合抗体ScFv-Fc通用表达载体的构建

为了构建一个可供自由替换的ScFv区,表达人小分子融合抗体ScFv-Fc的通用载体,利用RT-PCR技术扩增人抗体IgG1的Fc片段克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα,将一段人工合成的互补寡核苷酸链插入重组载体pPICZα/Fc中Fc区的上游,引入2个可供小分子抗体ScFv-Fc的ScFv区自由替换的限制性酶切位点。分别扩增人抗狂犬病毒以及抗乙型肝炎表面抗原的ScFv片段,克隆至已构建的通用载体pPICZα/Fc,在毕赤酵母中诱导表达。进一步在1L条件下对活性抗体进行发酵,并利用protein A亲和层析柱进行纯化。应用酵母基因组PCR、ELISA、Western blotting、活性检测等试验对此小分子抗体的表达进行生物学及免疫学分析。结果表明具有狂犬病毒抗原结合活性以及乙肝表面抗原结合活性的人源抗体分子均获得成功表达,1L发酵条件下表达量达到20~30mg/L, protein A亲和层析纯化后纯度＞95%。研究构建了可用于功能性抗体分子ScFv-Fc筛选和表达的通用载体并对其发酵、纯化条件进行了摸索,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

重组人小分子抗体ScFv-Fc发酵条件的优化及纯化

目的:研究重组人小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv-Fc的纯化方法。方法:分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合protein A亲和层析柱,对ScFv-Fc的纯化方法进行了研究。结果:确定ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH5.2的条件下,以0.5%甲醇诱导72 h。经过protein A亲和层析柱纯化后,ScFv-Fc纯度可达94%以上。结论:确定了ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件以及纯化方法,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

培养软骨细胞再形成生长板样软骨组织的研究

分离的家兔肋软骨的生长板软骨细胞在含１０％的胎牛血清的ＩＭＤＭ培养液中进行高密度培养。培养的软骨细胞经过增殖,分化重新构建形成了生长板样软骨组织;在组织学上,细胞的排列呈明显的方向性,肥大细胞位于上侧,增殖细胞位于下面从而形成明显的细胞分化 区带,即增殖,成熟区和肥大区,并且细胞纵向排列成柱状;在生化代谢方面,软骨细胞ＤＮＡ,蛋白多糖和碱性磷酸酶的合成具有动态的严格的时间规律性,与在体生长板软骨细     

伴刀豆球蛋白A对培养静止软骨细胞形态和DNA合成的影响

培养的静止软骨细胞用ConA处理后,细胞形态从扁平形变成多角形、圆形与球形,同时可以观察到细胞周边存在大量的具有折光特点的细胞外基质。ConA能够完全抑制软骨细胞DNA的合成,LD_(50)为0.4—1.0μg/ml。ConA抑制DNA合成的作用是可逆的。20mmol/L的MeMan能够完全阻断其对软骨细胞形态和DNA合成的影响。     

皮肤细胞复合改性聚乳酸构建组织工程皮肤

目的:探讨以改性聚乳酸为细胞外基质网架构建组织工程皮肤的可行性。方法:采用盐溶法制备机械性能得到部分改进的聚乳酸多孔泡沫网架,向改进的聚乳酸网架接种真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞,以普通聚乳酸支架作为对照,构建组织工程皮肤。体外培养一周,对网架进行形态学观察。主要观察指标:①一般形态观察②组织学观察。结果:复层组织工程皮肤在结构上与正常皮肤相似,具有真皮、表皮双层结构。改性聚乳酸网架上有双层细胞生长,生长的细胞与网架接触,并且在其表面形成较为明显而连续的细胞层。随着培养时间的延长,发生了一系列变化:表皮部分细胞层数逐渐增多,真皮部分细胞也逐渐增多,并向表皮层深入,位于表皮与网架之间。结论:双醛淀粉作为良好的增柔剂在改善聚乳酸网架的机械性能的同时,也具有良好的细胞相容性,不影响细胞的生长增殖和代谢,可以进一步用作组织工程皮肤的支架材料。     

伴刀豆球蛋白A对培养静止软骨细胞形态和DNA合成的影响

培养的静止软骨细胞用ＣｏｎＡ处理后,细胞形态从扁平形变成多角形、圆形与球形,同时可以观察到细胞周边存在大量的具有折光特点的细胞外基质。ＣｏｎＡ能够完全抑制软骨细胞ＤＮＡ的合成,ＬＤ５０为０．４－１．０μｇ／ｍｌ。ＣｏｎＡ抑制ＤＮＡ合成的作用是可逆的。２０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｅＭａｎ能够完全阻断其对软骨细胞形态和ＤＮＡ合成的影响。     

培养软骨细胞再形成生长板样软骨组织的研究

分离的家兔肋软骨的生长板软骨细胞在含10%的胎牛血清的IMDM培养液中进行高密度培养。培养的软骨细胞经过增殖、分化重新构建形成了生长板样软骨组织;在组织学上,细胞的排列呈现明显的方向性,肥大细胞位于上侧、增殖细胞位于下面从而形成明显的细胞分化区带,即增殖、成熟区和肥大区,并且细胞纵向排列成柱状;在生化代谢方面,软骨细胞DNA,蛋白多糖和碱性磷酸酶的合成具有动态的严格的时间规律性,与在体生长板软骨细胞分化的进程相一致,完整地模拟了在体软骨细胞分化及其代谢的全部过程。