肠杆菌基因间重复共有序列及ERIC-PCR

ERIC序列是近年来发现的存在于原核生物基因组中一类短的重复序列。该序列在染色体上的分布和拷贝数具种间特异性,根据序列中心高度保守的44bp的ERIC核心序列设计反向引物,可扩增出反映细菌基因组结构特征的谱带。由于ERIC-PCR快速简便,图谱重复性好,并可作为分子标记用于细菌的分类鉴定,所以,该方法已广泛应用到了科研和生产实践中;     

第一类肽链释放因子C端结构域参与调控终止密码子的识别过程

真核生物蛋白质翻译终止过程中,第一类肽链释放因子（eukaryotic polypeptide release factor, eRF1）利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和YxCxxxF模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。我们构建了四膜虫（Tetrahymena thermophilia）eRF1的N端结构域与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1,即Tt/Sc eRF1 和Tt/Sp eRF1。双荧光素酶检测结果证实,两种杂合eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1仅识别UGA密码子,与四膜虫eRF1一致,具有密码子识别特异性;而Tt/Sp eRF1可以识别3个终止密码子,无密码子识别特异性。为解释这一现象,将Sp eRF1的C结构域中的1个关键的小结构域中的氨基酸进行突变,与Sc eRF1相应位点的氨基酸一致。分析结果显示,突变体Tt/Sp eRF1识别密码子UAA和UAG的性质发生显著变化,说明第一类肽链释放因子的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。这提示,四膜虫eRF1识别终止密码子的特异性可能依赖于eRF1分子内的结构域间相互作用。本研究结果为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供了数据支持。     

重组生防菌308R(pKSH)的遗传稳定性研究

工程菌308R（pKSH）携带有梨火疫欧文氏杆菌的hrpN基因,能产生并分泌诱导植物抗病性蛋白-Harpin。该工程菌在无选择压培养基中生长50代,带有重组质粒pKSH的细胞占总菌量的23．1％,对照菌308R（pCPP430）的细胞占4．75％。将工程菌和对照菌喷雾到番茄叶面,保湿条件下的13d内,叶面菌量维持在10^5cfu／cm^2以上,自然条件下的5d内,菌量维持在10^4cfu／cm^2以上,其间308R（pKSH）的稳定性一直高于对照菌。因此证明工程菌308R（pKSH）比对照菌308R（pCPP430）稳定性有所提高,但还是不够理想。讨论了该工程菌不稳定的原因以及改进途径。     

截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ 在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

利用PCR、删除突变和基因重组技术构建了N端缺失3个氨基酸的人胰岛素样生长因子-[des(1-3)IGF-]的表达载体pExSec/IGF,在大肠杆菌蛋白酶缺陷株BL21(DE3)中,通过用IPTG于超常规的12℃低温诱导16h,des(1-3)IGF-获得了可溶性表达。表达水平达到可溶性细菌总蛋白约15%。经超滤和SephadexG-50凝胶过滤,des(1-3)IGF-纯度分别达到49%和82%,且表现出明显的免疫学活性和刺激Balb3T3细胞增殖的生物学活性。     

肽链释放因子和核糖体蛋白L11在八肋游仆虫细胞中的定位

原生动物纤毛虫是一类单细胞真核生物,其蛋白质合成终止过程中密码子使用的特殊性使其成为研究蛋白质合成终止机制的一个经典模型。为了能够有效地分析生物大分子在该细胞中的功能作用位点,本研究根据该生物染色体结构的特征,构建了含有红色荧光蛋白基因的大核人工染色体EoMAC_R,并与之前构建的含绿色荧光蛋白基因的大核染色体EoMAC_G一起,对蛋白质合成终止有关的3个重要因子核糖体大亚基蛋白L11、多肽链释放因子eRF1和eRF3在八肋游仆虫细胞中进行了荧光共定位分析。结果显示,在八肋游仆虫细胞中,蛋白质翻译过程主要位于"C"形大核内侧区域。构建的人工染色体能够作为一种有效的工具,对目的蛋白质在八肋游仆虫细胞中进行定位分析。     

重组生防菌308R(pKSH)的遗传稳定性研究*

工程菌308R(pKSH)携带有梨火疫欧文氏杆菌的hrpN基因,能产生并分泌诱导植物抗病性蛋白-Harpin。该工程菌在无选择压培养基中生长50代,带有重组质粒pKSH的细胞占总菌量的23.1%,对照菌308R(pCPP430)的细胞占4·75%。将工程菌和对照菌喷雾到番茄叶面,保湿条件下的13d内,叶面菌量维持在10⁵cfu/cm²以上,自然条件下的5d内,菌量维持在10⁴cfu/cm²以上,其间308     

番茄内生菌分离及其ERIC—PCR指纹图谱分析

介绍了一种分离植物内生菌和研究其多样性的方法。用无菌水、化学试剂、紫外线和机械去表皮4种方法对番茄植株进行处理,然后分别用牛肉膏蛋白胨、高氏一号和PDA(加链霉素抑制细菌生长)3种培养基分离内生菌。确定了最适宜的去除非内生菌的方法。经分离、纯化得到148株大小、形态、颜色各异的内生菌分离物。对其中43株进行ERIC—PCR扩增,32株有扩增条带的菌株可分为28种。把纯化的菌株分别与番茄早疫病菌进行平板对峙培养。筛选出抑菌效果较好的3株菌。     

原生动物八肋游仆虫cDNA文库的构建

细胞内蛋白质合成过程是一个由多种蛋白质相互作用参与调节的开放系统,形成了复杂的mRNA代谢和蛋白质翻译为核心的基因表达调控的网络和信号转导途径。【目的】为了获得更多参与调节蛋白质合成终止过程的蛋白质种类和功能信息,进一步了解其中的网络和信号转导途径,本研究构建了原生动物八肋游仆虫的cDNA文库。【方法】构建过程严格遵循Clontech公司的BD MatchmakerTM Library ConstructionScreening kit提供的方案进行文库构建和筛选.【结果】首次得到了可用于筛选功能基因的原生动物纤毛虫的cDNA文库,文库滴度为2.437×107cfu/mL。利用第二类肽链释放因子为诱饵,筛选得到了一些可能与之相互作用的蛋白质,其中包括一个可能编码RNA解旋酶的基因序列。该文库为进一步筛选和研究八肋游仆虫功能基因提供了便利的平台。     

产harpin的成团泛菌工程菌308R(pCPP430)遗传稳定性的研究*

成团泛菌工程菌３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０）带有梨火疫欧文氏杆菌的与过敏反应和致病性有关的基因簇 （ｈｒｐ）,可以产生能诱导植物抗病性的蛋白质ｈａｒｐｉｎ。该工程菌在ＬＢ液体培养基中生长５０代后,带有重 组质粒ｐＣＰＰ４３０的细胞占总菌量的 １％,带有载体ｐＣＰＰ９的细胞为４６％。工程菌喷雾到番茄叶面,保湿条 件下叶面菌量维持在 １０^５ｃｆｕ／ｃｍ２以上,其中带有 ｐＣＰＰ４３０质粒的菌维持在 ４０％以上,带有 ｐＣＰＰ９载体的 菌维持在８０％以上。因此,携带ｈｒｐ基因簇的质粒ｐＣＰＰ４     

ERIC-PCR在人工混合菌体系中的检出灵敏度

提取大肠杆菌DHSα和阴沟肠杆菌(E-26R)的基因组DNA,进行ERIC-PCR,可以分别得到稳定而独特的DNA指纹图谱;模板量的变动范围从10～100ng都不会影响其图谱的稳定性;在图谱中DHSa和E-26R各自均有一条含量最大的特征带,其不易受实验环境和实验条件的干扰而发生变化。把DHSa和E-26R按比例混合,提取混合菌基因组DNA,进行ERIC-PCR,结果表明：混合菌的DNA指纹图谱为各纯菌图谱的叠加,亦具有稳定性;通过对凝胶电泳图谱中特征带的分析,可以看出：当DHSα的菌含量达到总菌量的0．5％时,可被ERIC-PCR方法清楚地检测出来。为ERIC-PCR用于土壤微生物和环境微生物的研究,特别是用于发酵工业中杂菌污染的检测与鉴定提供了一定的依据。