猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

Angioarrestin(hARPl)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

 Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE 检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET 22b（+）表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明：通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.     

糖基因Glt8d2重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建新糖基转移酶基因Glt8d2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗GltSd2蛋白多克隆抗体并进行鉴定。方法应用RT—PCR技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增Glt8d2目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a（＋）-Glt8d2。转化大肠埃希菌B121,异丙基-D-半乳糖苷诱导并通过SDS—PAGE凝胶电泳分析、Western印迹分析、生物质谱分析证实Gh8d2重组蛋白表达正确。大量表达后利用Ni’亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗Gh8d2蛋白的多克隆抗体。以纯化的Glt8d2重组蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western印迹和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。结果扩增获得Glt8d2基因片段,成功表达了Gh8d2重组蛋白,经SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析得到证实。成功获得重组蛋白及兔抗Gh8d2多克隆抗体。ELISA检测证实多克隆抗体效价〉1：320000。免疫组织化学分析显示,该基因编码的糖基转移酶在肝实质细胞内呈胞质模式表达分布。结论利用大肠埃希菌B121能够成功表达Gh8d2重组蛋白,获得高特异性、高效价兔抗Glt8d2重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究Glt8d2基因的生物学功能研究奠定了基础。     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

spindlin1基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的:明确人新基因spindlin1的组织表达谱、相互作用蛋白。方法与结果:应用PCR技术获得spindlin1的开放读框,并将其插入原核表达载体pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,融合蛋白GST-Spindlin1获得了可溶性表达。用SDS-PAGE胶上的目的条带做抗原制备了多克隆抗体,进行了抗体纯化。结论:spindlin1在OVCar3细胞中可能以二聚体形式存在,这一现象还有待于进一步研究。     

小鼠骨保护素配基胞外片段的表达、纯化及生物活性分析

骨保护素配基(OPGL)是调节破骨细胞分化和成熟的核心细胞因子。由小鼠骨组织提取总RNA,RTPCR扩增得到小鼠OPGL胞外片段(sOPGL)cDNA,以特定策略克隆人表达载体pET-42a( ),以便使未来表达产物的融合标签序列能够完全被因子Xa切除。重组载体在大肠杆菌中诱导表达可获得高水平的47kD产物,Western blotting证实它可被OPGL抗体识别。经Glutathione-sepharose 4B亲和层析,除融合蛋白外,还有一约30 kD蛋白与层析柱发生了特异性亲和。该30kD蛋白可被GST-IGF-I多克隆抗体识别,但不能被OPGL抗体识别,提示它的产生乃由于融合蛋白在融合位点附近发生裂解。融合蛋白经Xa因子裂解和进一步纯化,得到分子量约17．5kD的sOPGL。生物活性分析证明,重组sOPGL可以促进OLC的生成,并呈现剂量依赖关系。     

Purification and immunogenicity of a recombinant Bordetella pertussis S1S3FHA fusion protein expressed by Streptococcus gordonii

Acellular pertussis vaccines typically consist of antigens isolated from Bordetella pertussis, and pertussis toxin (PT) and filamentous hemagglutinin (FHA) are two prominent components. One of the disadvantages of a multiple-component vaccine is the cost associated with the production of the individual components. In this study, we constructed an in-frame fusion protein consisting of PT fragments (179 amino acids of PT subunit S1 and 180 amino acids of PT subunit S3) and a 456-amino-acid type I domain of FHA. The fusion protein was expressed by the commensal oral bacterium Streptococcus gordonii. The fusion protein was secreted into the culture medium as an expected 155-kDa protein, which was recognized by a polyclonal anti-PT antibody, a monoclonal anti-S1 antibody, and a monoclonal anti-FHA antibody. The fusion protein was purified from the culture supernatant by affinity and gel permeation chromatography. The immunogenicity of the purified fusion protein was assessed in BALB/c mice by performing parenteral and mucosal immunization experiments. When given parenterally, the fusion protein elicited a very strong antibody titer against the FHA type I domain, a moderate titer against native FHA, and a weak titer against PT. When given mucosally, it elicited a systemic response and a mucosal response to FHA and PT. In Western blots, the immune sera recognized the S1, S3, and S2 subunits of PT. These data collectively indicate that fragments of the pertussis vaccine components can be expressed in a single fusion protein by S. gordonii and that the fusion protein is immunogenic. This multivalent fusion protein approach may be used in designing a new generation of acellular pertussis vaccines.     

GGNBP1抗体制备及小鼠组织表达谱分析

体外实验研究表明配子生成素结合蛋白1(GGNBP1)可能与GGN1相互作用形成睾丸特异性复合物,在精子生成过程中发挥作用.从小鼠睾丸总RNA中反转录扩增Ggnbpl全长cDNA,构建表达质粒,在大肠杆菌中表达GGNBP1,经聚丙烯酰胺凝胶纯化后免疫新西兰白兔,制备兔多抗血清.镍离子金属螯合柱纯化表达的GGNBP1蛋白,与NHS活化基团交联,制备GGNBP1抗体亲和层析柱,纯化GGNBP1多抗.在293FT细胞中瞬时表达Myc-GGNBP1融合蛋白,用于Mvc单抗验证GGNBP1抗体特异性,结果证明获得了特异性的GGNBP1抗体.分别制备小鼠脑、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、卵巢、睾丸和子宫组织匀浆,用GGNBP1抗体进行Western印迹分析,结果仅在睾丸组织匀浆中检测到GGNBP1特异性条带,证明GGNBP1是睾丸特异性表达蛋白.     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体。方法以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamH I和Nhe I双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达。以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔,制备Klotho多克隆抗体。结果表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15％左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1：10000,Western印迹分析验证了抗体特异性。结论GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础。     

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins, OBPs）参与气味分子的识别,在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。本研究旨在克隆中华蜜蜂 Apis cerana cerana OBP3基因,以制备多克隆抗体。【方法】运用RT-PCR技术从中华蜜蜂头部总RNA中扩增OBP3基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中诱导表达获得融合蛋白质,融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性,并采用荧光定量PCR检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357）,大小为444 bp。 SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40 000,且具有很高的特异性。荧光定量PCR结果表明,AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P<0.01）,胸部中次之（P<0.01）,头部和腹部中显著低表达,后两者表达量差异不显著（P>0.05）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达,并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体,为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础 。     

人前列腺特异膜抗原膜外区基因的克隆表达及抗体的制备

利用RT PCR技术 ,从前列腺癌组织总RNA中扩增人前列腺特异膜抗原 (PSMA)基因编码区序列 ,克隆至pcDNA3.1载体 ,以此为模板再次PCR扩增出PSMA膜外区cDNA(edPSMA) ,序列测定表明克隆获得的PSMA及edPSMA与基因库所登录的序列相一致。构建原核表达质粒pMAL c2x edPSMA ,经IPTG诱导表达的MBP edPSMA融合蛋白分子量约 12 0kD ,Westernblot证实表达产物可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (Amyloseresin)亲和层析纯化蛋白质可得到电泳均一的融合蛋白 ,免疫BALB C小鼠制备多抗 ,获得效价为 1∶12 80 0的多克隆抗体 ,该抗体可用于前列腺癌组织标本PSMA表达的检测     

大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备

为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体.采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体.用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价.序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的.本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上.制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000.获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础.     

青杄FKBP12基因原核表达和多克隆抗体的制备

目的:制备青杄FKBP12基因的多克隆抗体,为进一步分析FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用PCR方法扩增FKBP12基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转化入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔,进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。     

登革2型病毒非结构蛋白NS4B的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4B,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法：扩增编码登革2型病毒NS4B的24-238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中回收融合蛋白;用纯化后的融合蛋白免疫BALB／c鼠制备多克隆抗体,采用间接免疫荧光法检测抗体效价。结果：原核表达了NS4B-GST融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,抗体效价为1：800。结论：登革2型病毒NS4B的24-238位氨基酸残基可诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,这为研究NS4B的结构与功能奠定了基础。     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

Characterization of LC-HCC fusion protein of botulinum neurotoxin type A

Botulinum neurotoxins (BoNTs) are highly potent toxins that inhibit neurotransmitter release from peripheral cholinergic synapses. The gene for encoding the full length light chain with H(CC) (binding) domain of Clostridium botulinum neurotoxin A was synthesized and cloned into a bacterial expression vector pQE30-UA and produced as an N-terminally six-histidine-tagged fusion protein (rBoNT/A LC-H(CC)). This protein was expressed in two different strains of Escherichia coli namely BL21(DE3) and SG13009. Expression at 37 °C revealed localization of rBoNT/A LC- H(CC) in inclusion body whereas it was expressed in soluble form at 21°C. The recombinant fusion protein was purified by nickel affinity gel column chromatography and identified by monoclonal antibody and peptide mass fingerprinting. The recombinant protein was shown to bind with synaptic vesicles and gangliosides (GT1b) using enzyme-linked immunosorbent assay. The rBoNT/A LC-H(CC) was also found to be highly active on its substrate (SNAP-25) from rat brain, indicating that the expressed and purified rBoNT/A LC-H(CC) protein retains a functionally active conformation. Biologically active recombinant fusion protein was also evaluated for its immunological potential.     

转录因子Cdx—2抗体的制备及对不同种属acat2启动子分析的应用

转录因子Cdx 2是一种同源盒蛋白 ,它在小肠细胞的基因表达调控和在肿瘤发生过程中起重要作用。通过融合表达小鼠Cdx 2的保守区 (mCdx 2D)、制备Cdx 2的抗体 ,进而利用该抗体检测Cdx 2在多种细胞中的表达 ,以及应用于分析不同种属Cdx 2对酰基辅酶A :胆固醇酰基转移酶 2基因 (acat2 )启动子的结合作用。首先 ,通过PCR扩增编码mCdx 2D的长 2 16bp的DNA片段 ,并将其克隆到表达质粒pGEX 4T 1中 ,构建了Cdx 2片段与GST的融合表达克隆pGEX mCdx 2D ;经SDS PAGE分析结果表明 ,融合蛋白GST mCdx 2D在大肠杆菌BL2 1(DE3)中得到可溶性表达 ;通过亲和层析分离纯化 ,获得重组表达的GST融合蛋白GST mCdx 2D。进而 ,利用该纯化的融合蛋白免疫动物制备高滴度的Cdx 2抗血清 ,经亲和吸附纯化后得到多克隆抗体。最后 ,Western印迹和EMSA实验分析结果表明 ,该抗体可用以检测不同种族 (人和鼠 )的、变性或非变性的Cdx 2 ,并显示有较好的抗Cdx 2的专一性和较高的灵敏度。同时 ,观察到Cdx 2在分化的人小肠细胞Caco 2中有高表达 ,显示具有分化依赖性 ;从抗Cdx 2抗体能识别作用于特异结合DNA的Cdx 2而形成超迁移 (supershift) ,证实了Cdx 2的确结合于不同种族 (小鼠和人 )的acat2启动子 (均存在Cdx 2元件 ) ,提示Cdx 2可能参与aca     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRHcDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答。     

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP 1的功能     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。