D97N突变对光受体蛋白古紫质4质子泵和能量转换效率的影响

古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)是新近发现的古生菌Halobacterium species xz515红膜上唯一的光敏视黄醛蛋白,具有和细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)相似的质子泵功能,但在中性p H条件下,其质子释放和摄取顺序与bR相反。针对质子供体天冬氨酸97(Aspartic acid 97,D97)对aR4光循环;特别是对质子释放摄取顺序和菌株ATP生成率的影响,采用基因定点突变技术,构建了aR4的单突变体D97N,以及相对应的bR单突变体D96N。采用紫外-可见吸收光谱和闪光动力学光谱技术初步研究突变对视黄醛键合区、光反应中间态M态和O态、质子泵功能以及菌株ATP生成率的影响。结果表明,D97N突变对视黄醛紫外-可见光吸收波长没有太大影响,但造成M态衰减时间的显著延长、质子泵功能的消失及菌株ATP的生成率大幅降低。与bR中的D96作用相比,D97对aR4质子功能的影响有所不同,这可能与D97所处的一个更为疏水性的胞外侧环境有关。     

M145F/F146M突变对光受体蛋白细菌视紫红质和古紫质4光循环的影响 *

古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)与细菌视紫质(bacteriorhodopsin,bR)同属于盐杆菌科,同源性59%,均为光驱质子泵。其功能是在光照条件下将质子由胞内泵到胞外形成跨膜质子梯度,该梯度差被膜上另外一种蛋白ATP合成酶用于ATP的合成,从而完成光能向生物能的转化。aR4和bR具有相似的光循环过程,但质子传递时序不同,aR4是先从胞内吸收质子再将质子释放到胞外,而bR恰好相反。甲硫氨酸-145是位于bR视黄醛发色团键合区的一个重要残基,对其光循环有着重要的影响,而在aR4中处在相应位置上的苯丙氨酸-146是其视黄醛键合区与bR唯一不相同的残基。因此通过定点突变,采用紫外可见吸收光谱、动力学光谱、质子泵功能检测、低温透射红外光谱等手段对比分析研究M145F和F146M单点突变对bR和aR4光循环造成的影响,有助于深入理解aR4结构与功能的关系。研究结果表明,M145F突变造成了bR光循环L的丢失和质子泵功能的减弱,而F146M突变并未对aR4的光循环造成显著影响,且突变后aR4质子释放时序没有反转,表明该位置上的残基在两个体系中的作用不尽相同。     

W86F/W86A突变对细菌视紫红质光循环影响的差异性分析

细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,bR)是一种光驱受体蛋白,每个活性单元由3个单体组成,每个单体由一分子视蛋白和一分子的视黄醛发色团共价结合而成,其功能为从胞内向胞外定向传输质子,利用形成的质子浓度梯度将光能转化为化学能.光照后视黄醛发色团构型发生all-trans向13-cis转变,蛋白的构象也随之发生了一系列具有稳定中间态的变化并驱动质子的定向传递.为探讨bR视黄醛键合区保守性氨基酸色氨酸86 (Tryptop-han86,w86)对其光循环中间态和质子泵功能的影响,本研究采用定点突变技术将W86突变为侧链大小不同的F86和A86,通过原位紫外-可见光吸收光谱、闪光光解光谱、pH滴定、固体核磁共振等技术手段,探究W86F和W86A突变对bR光循环及质子泵功能影响差异性的分子机制.结果 表明,W86F和W86A突变均造成了bR暗适应状态下视黄醛顺反异构平衡向顺式构型占优的方向移动,且W86F突变可造成反式构型的完全消失.此外,无论是W86F还是W86A突变都造成了蛋白光循环中间态的减弱且衰减延长,以及质子泵功能减弱,但影响机制各有所不同,这可能与这两个突变对视黄醛多烯链上电子云的分布以及周围残基造成的扰动程度不同有关.     

Gloeobacter violaceus视紫红质在大肠杆菌中的异源表达与功能评价

质子泵型视紫红质是一种在自然界广泛存在的简单光合系统,它可以结合视黄醛,在光照下将质子由胞内泵向胞外,形成质子梯度势,在一定程度上促进ATP的合成。在非光合工程菌中引入视紫红质将光能转化为化学能有助于促进微生物生长、生产以及提高细胞耐受性。文中在大肠杆菌Escherichia coli中异源表达了来自Gloeobacter violaceus PCC 7421的质子泵型视紫红质Gloeorhodopsin(GR),并验证了它的功能活性。在大肠杆菌中表达时,GR可以正确行使光驱质子泵功能,最大吸收波长位于539 nm。GR分布在细胞膜表面,没有在胞内形成包涵体。在通过核糖体结合位点(Ribosome binding site,RBS)优化的手段提升GR的表达水平之后,观察到了胞内ATP水平的提高,证实在特定的条件下,GR可以为异源宿主带来额外的能量补充。     

Hsp70核苷酸结合域突变体影响酶活的分子动力学模拟研究

分子伴侣蛋白Hsp70氮端核苷酸结合域（NBD, nucleotide-binding domain）的ATP酶活性变化对其行使分子伴侣功能具有重要作用。本文采用分子动力学模拟方法研究酵母分子伴侣Hsp70氮端NBD内残基A17,R23,G32和R167点突变对其ATP酶活性区域构象影响及功能关系。结果表明,突变体A17V,T23H,G32S的ATP结合口袋袋口的loopl（第一个转角,连接p1与p2）结构柔性增强,活性残基T11侧链明显向内移动,从而更加接近ATP的γ-磷酸基团,更容易使ATP水解。这可能蕞终导致ATP酶活性增强,从而引起分子伴侣功能的变化。     

N-溴代琥珀酰亚胺修饰菌紫质中色氨酸的光谱学研究

采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱方法研究了菌紫质（Bacteriorhodopsin,bR）中的8个色氨酸（Tryptophan,Trp）残基在被N-溴代琥珀酰亚胺（N-bromosuccinimide,NBS）修饰过程中的残基数目及对应的光谱变化。研究结果显示：随着NBS／bR摩尔比例增加逐渐被修饰的Trp残基有4个左右,如果NBS过量,则Trp残基的修饰个数最终可迭6～7个;伴随化学修饰出现Trp残基特征荧光峰值下降及峰位蓝移。研究结果揭示了bR中Trp残基可能的三种结构分布,对于进一步弄清bR中Trp-视黄醛（Retinal）偶联能量传递、单独Trp残基的荧光寿命和Tm残基在膜蛋白结构和功能中的作用具有积极而重要的意义。     

白色念珠菌CYP51蛋白功能性氨基酸残基定点突变、蛋白表达及活性测定

实验设计了白色念珠菌CYP51蛋白功能性氨基酸残基突变体Y118A、Y118F、Y118T、S378A、S378T、H310A、H310R, 并转入基因工程菌D12667中表达。用Western及紫外分光光度法定性、定量检测蛋白, 用GC-MS法测定蛋白代谢活性。结果表明, 成功表达目标蛋白, 蛋白诱导表达量接近微粒体蛋白总量的25%。活性测定表明, 表达的野生型蛋白保持其对天然底物的代谢能力; 相较于野生型蛋白, 突变体蛋白代谢活性不同程度改变, 最多可下降1/2左右。因此, 本研究中成功表达了野生型和     

酰化菌紫质的动力学光谱及光电特性研究

用人工双分子膜(BLM)技术及动力学光谱研究了赖氨酸残基在紫膜的结构和功能中所起的作用.酰化基团与菌紫质(bR)分子中的赖氨酸残基的ε氨基作用,使光照后bR的跨膜质子迁移信号及膜的充放电速度变慢,光循环中间产物M412的产量下降,半衰期延长.但UV/Vis吸收光谱表明酰化并未破坏bR中视黄醛的构象环境.在高pH或高盐浓度下,酰化的影响降低.这些结果表明:赖氨酸残基并不是泵出质子的提供者,没有直接参与质子的跨膜输运,而是通过表面电位来影响bR的质子泵功能.     

变形菌视紫红质十年的回顾与展望

变形菌视紫红质(proteorhodopsin,PR)是一类吸光色素膜蛋白,它是由7个跨膜ɑ-螺旋(A～G)组成的视蛋白(opsins)与色素视黄醛(retinal)通过共价键结合而形成。PR广泛存在于海洋和淡水水域的微生物中,是一种质子泵型的视紫红质,可在光的驱动下将质子从细胞质泵到胞质间隙,从而在细胞内外产生质子梯度,形成的化学势能被用于合成ATP、物质的跨膜运输以及驱动鞭毛运动等方面。据估算含PR的细菌在海洋水域中约占总细菌的13%,而每个含PR的细胞中的PR分子数约为2.5×104个。对PR功能的研究表明PR具有增强其宿主菌抵抗外界不良环境的能力;而对于PR三维结构的研究对PR的作用机理及其功能的研究将有更进一步的推动作用。     

氮氧自由基自旋探针R1在特定空间位点上对bacteriorhodopsin产生颜色调谐效应的机理分析

蛋白质结构研究中的氮氧自由基自旋探针R1,在特定的空间位置上会对bacteriorhodopsin的结构与功能产生影响。该文作者发现:将bacteriorhodopsin中远离视黄醛的第192位Gly替换为自旋探针R1后,产生了显著的颜色调谐,最大吸收峰有28nm的蓝移。但用R1替换Gly192邻近的Gly195和Ala196,未产生颜色调谐效应;替换螺旋E末端的Val130和Tyr131,以及螺旋B末端的Leu62,均无颜色调谐。进一步表征bacteriorhodopsin光循环中间体O和M的衰减过程发现:R1替换前,Gly192Cys(+)的O态衰减寿命约为847.7ms;但替换后,其衰减显著加快至308.2ms。M态的衰减寿命在R1替换后反而显著延长,尤其是慢组分Ms从24.8ms延长至83.6ms。Gly192R1的顺磁共振信号揭示:该位置上的R1处于低运动性状态,表明R1可能与局部环境的结构组分发生了直接作用。晶体结构分析发现:R1可能直接与质子传递通道中的三体水分子作用。由于三体水分子通过长程的氢键网络与视黄醛活性中心相连,并且参与质子在bacteriorhodopsin中的传递,因此自旋探针R1...     

MRP8过表达促进重组酿酒酵母外切纤维素酶生产

增强酿酒酵母纤维素酶分泌能力,为提高利用联合生物加工生产纤维素乙醇的效率提供基础。采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,在分泌表达外切纤维素酶CBH1的酿酒酵母Y294中过表达线粒体核糖体蛋白基因MRP8。与对照菌株相比,过表达MRP8重组酵母的胞外CBH1酶活提高了约80%。实时定量PCR结果分析表明,在MRP8过表达突变体中,CBH1转录水平高于对照菌株,但是与蛋白折叠和分泌相关的关键基因转录水平没有明显变化。在刚果红平板和含有衣霉素或二硫苏糖醇的平板上生长没有受到影响。胞内ATP含量和活性氧积累未发现显著差别。本研究表明MRP8过表达促进外切纤维素酶的生产。     

P2X4受体的结构功能关系研究进展

嘌呤能受体P2X4是三磷酸腺苷(ATP)-门控的阳离子通道,对生物体内多种重要生命活动起一定的调节作用。二次跨膜的三聚体通道P2X4受体的三维空间组成是由胞外结构域、跨膜域及胞内N-、C-端组成。ATP的三磷酸基团能被位于亚基界面的ATP结合口袋的带正电氨基酸特异性识别,嘌呤环则被疏水氨基酸和部分氨基酸的主链氧所识别。P2X4受体激活后,胞外阳离子更多是通过侧窗路径进入细胞内。就P2X4受体的空间结构、配体的识别、离子通透途径及门控机制作一综述。     

人双专一性磷酸酶活性位点Cys^124附近精氨酸突变及功能

为研究人双专一性磷酸酶活性位点Cys12 4 附近 3个带正电的精氨酸对酶催化功能的影响 ,用QuikChange定点突变方法获得 6个突变体 :R12 5L、R130 L、R130 K、R130 L/S131A、R158K和R158L。将含突变基因的重组质粒转化大肠杆菌菌株BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达获得的目的蛋白质均以可溶形式存在。通过镍离子亲和层析纯化得到纯度大于 90 %的蛋白质。对人痘苗病毒H1相关磷酸酶 (VHR)及其突变体进行稳态动力学参数和竞争性抑制常数Ki 的测定 ,结果显示上述Arg130 和Arg158突变体的kcat/Km 值都较野生型有大幅度下降 ,而Ki 值有明显上升 ,表明 130和 15 8位的精氨酸是VHR活性所必需 ,而且可能与底物上带负电的磷酸基团结合有关。另外 ,单突变体R130 L和双突变体R130 L/S131A之间的kcat值相差很小 ,提示Arg130 单点突变后可能破坏了Ser131与Cys12 4 间的氢键。再者 ,R12 5L、R130 L和R158L突变体都降低了砷酸盐结合亲和性 ,暗示这 3个精氨酸残基侧链上的正电荷可能有助于底物与酶的结合。     

长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点

【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。     

纳米银对果蝇化蛹、羽化、寿命及细胞凋亡和蛋白表达的影响

纳米银因具有强有效的抗菌作用而被广泛应用于医药领域,然而它存在潜在的生物毒性.本研究选取经典的模式生物黑腹果蝇,探究纳米银对生物体的毒性作用机理.测定不同浓度纳米银处理下的Oregon R、w1118、MTF突变体等品系的化蛹率、羽化时间、羽化率及寿命;用rpr-lacZ品系的lacZ活性测定不同纳米银浓度处理下翅成虫盘的细胞凋亡情况; 通过SDS-PAGE研究不同浓度纳米银浓度处理下MTF突变体中肠蛋白的表达差异,并利用质谱分析差异蛋白的氨基酸序列.结果显示: 纳米银处理浓度升高至200 μg·mL^-1及以上时,MTF突变体化蛹率和羽化率显著降低; 纳米银处理浓度升高至800 μg·mL^-1时,Oregon R和w1118化蛹率和羽化率显著降低,而化蛹时间和羽化时间与纳米银处理浓度无显著关系.不同浓度纳米银处理对Oregon R和w1118的寿命无影响,而200 μg·mL^-1纳米银显著降低MTF突变体平均寿命.随纳米银处理浓度升高,细胞凋亡也逐渐增多.SDS-PAGE及质谱分析表明,随纳米银浓度上升,质子泵ATP激酶、热激蛋白、糖代谢相关酶系等蛋白的表达量上升.本研究表明,高浓度的纳米银会促进细胞凋亡致使部分蛋白表达量发生改变,从而降低果蝇存活率,为后续进一步了解其毒性作用机理提供理论依据.     

提高产抗生素链霉菌紫外诱变正变率的研究

将UV诱变了的产抗生素链霉菌（Streptomyces sp.）AP 19-1菌株之孢子,置于适宜的生长温度27℃与接近抑制生长的胁迫温度33℃下培养,结果表明：在33℃下生长获得的子代菌株中,产抗生素水平超过其出发菌株的正向突变体所占的比例,明显比在27℃下培养的高。27℃下培养,正向突变体占总子代菌株数的25.8%,而在33℃下培养则为58.1%。用17种随机引物对出发菌株与UV诱变子代菌株进行总DNA的RAPD测验证明,在接近抑制生长的温度33℃下培养获得的子代,发生在其DNA水平上的变异程度比在27℃的要高得多。这一方法能较大幅度提高链霉菌紫外诱变育种的工作效率,同时也为链霉菌经紫外诱变后突变形成机制的进一步研究提供了新途径。Abstract: UV irradiated spores of Streptomyces sp. AP 19 -1 strain that can produce antibiotics were incubated at 27 ℃, and 33 ℃ which is close to inhibiting growth temperature, respectively. The results showed that there were much more forward mutants, whose level of producing antibiotics is higher than that of original strain, among the offspring of UV irradiated spores grown at 33 ℃, compared to that grown at 27 ℃. The percentage of the forward mutants was 25.8 % at 27 ℃ and 58.1% at 33 ℃. The progeny strains and the original strain were tested by RAPD using total DNA with 17 primers. It was demonstrated that more variations occurred in the chromosomal DNA of the progeny strains grown at 33 ℃ than in that at 27 ℃. This method facilitates increasing the efficiency of induced mutagenesis in breeding and provides a new way to study the mechanisms of mutation formation in UV irradiated Streptomyces sp. cells.     

甲基营养菌 Methylobacterium sp MB200 中crtI基因的克隆及表达

八氢番茄红素脱氢酶( CrtI)催化八氢番茄红素经过4次脱氢合成番茄红素,或者经过3次脱氢合成链孢红素,在类胡萝卜素的生物合成中发挥重要的作用.以甲基营养菌Methylobacterium sp MB200为原始菌株,首先采用转座子突变技术构建部分突变体库共11552株,筛选得到33株颜色发生变化的目的突变体,随后利用分子克隆技术从目的突变体中获得crtI基因的完整ORF,长为1539 bp,编码512个氨基酸.与来自M.populi BJ001、M.chloromethanicum CM4和M.extorquens AM1的crtI一致性均为93％.将crtI与载体pCM80连接得到重组质粒pCM80-crtI,导入原始菌株中得到重组菌MB200/pCM80-crtI.测定原始菌株与重组菌株的CrtI酶活,结果发现,重组菌株CrtI的酶活与原始菌株相比约提高了40％.实验结果为完善甲基营养菌中类胡萝卜素的生物合成代谢途径提供了理论参考.     

紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株

以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株,以这些菌株产蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶、糖化酶)活力大小为评价标准,筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。将米曲霉Y29菌株应用于黄豆酱的生产中,并与目前工业生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042菌株进行比较。性能实验结果表明米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标两者的差异并不显著;制酱品质试验结果表明,米曲霉Y29菌株的酱香更浓郁一些,氨基酸态氮含量达到0.77g/100mL,高于米曲霉沪酿3.042菌株,其它指标均符合国家标准GB2718-1996。     

短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶脱氢催化机理

【目的】为研究短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶(sNPEO-DH)的脱氢氧化机制(基因克隆于Ensifer sp.AS08),我们进行了以下实验。【方法】采用同源序列比对及同源建模的方法筛选出与其辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)异咯嗪基邻近的4个氨基酸残基。以定点突变方法分别构建了突变体,并进行了重组蛋白的表达纯化和酶活力测定。【结果】野生型和突变体的酶学动力学实验表明,突变体N90A和N509A对亲水性底物聚乙二醇(PEG1000)的相对活性分别降低为51%和89%,对疏水性底物sNPEO的活性分别降低为26%和40%,说明氨基酸残基N90和N509可能与底物的结合相关。突变体H465A的相对活性丧失了90%以上,突变体N507A完全丧失活性;瞬时"停-流"检测实验进一步证明N507A突变体阻断了底物向FAD传递质子的过程,突变体H465A阻断了对FAD还原形成的FADH2脱氢再生的过程。【结论】以上结果说明N507和H465为sNPEO脱氢酶活性中心中参与对底物氧化脱氢及FADH2脱氢再生进行下一次反应的催化位点。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素（Plt）两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的15kb片段,中间插入编码Kmr的DNA片段,获得rsmA-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R-。突变株M18R-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20%。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。