抑制性寡脱氧核苷酸的生物学效应及研究进展

DNA对于机体免疫系统具有很多复杂的作用。存在于细菌DNA中的刺激性CpG基序能够促进机体免疫细胞分泌多种细胞因子,使机体产生偏向Th1方向的免疫应答,而抑制性寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)可以选择性阻断刺激性CpG诱导的免疫激活作用。抑制性ODN按其结构不同大致分为三类,它可能通过影响细胞对CpG-S的结合及摄取、降低CpG-S特异性受体TLR9的表达发挥抑制作用。本综述主要介绍抑制性ODN的结构特征、作用机制和它在一些疾病中发挥的作用。     

微生物未甲基化CpG DNA对动物肠道的免疫调节作用

摘要:微生物未甲基化CpG DNA为富含未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的DNA片段,能够被动物肠道细胞Toll样受体家族中的TLＲ9 受体(Toll-like receptor 9,TLR9)特异性识别。未甲基化CpG DNA作为一种动物肠道免疫刺激因子,不仅能够直接调节肠道固有免疫应答,同时还能间接介导肠道适应性免疫应答。未甲基化CpG DNA具有调节机体免疫应答作用的应用前景,成为免疫佐剂开发的研究热点。本文主要综述微生物未甲基化CpG DNA基本概念、受体TLR9的特征、调节动物肠道免疫作用及其信号机制,同时阐述了未甲基化CpG DNA作为免疫佐剂在实际中的应用,最后对微生物未甲基化CpG DNA研究与开发利用前景进行了展望。     

抑制性寡脱氧核苷酸的生物学效应及研究进展

DNA对于机体免疫系统具有很多复杂的作用。存在于细菌DNA中的刺激性CpG基序能够促进机体免疫细胞分泌多种细胞因子,使机体产生偏向Th1方向的免疫应答,而抑制性寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）可以选择性阻断刺激性CpG诱导的免疫激活作用。抑制性ODN按其结构不同大致分为三类,它可能通过影响细胞对CpG-S的结合及摄取、降低CpG-S特异性受体TLR9的表达发挥抑制作用。本综述主要介绍抑制性ODN的结构特征、作用机制和它在一些疾病中发挥的作用。     

质粒骨架的CpG修饰对DNA疫苗免疫原性的影响

目的：探讨不同类型的CpG对DNA疫苗免疫应答的影响。方法：将3种不同类型的CpG通过骨架改造的方式引入核酸疫苗的质粒载体骨架中作为内源性佐剂,以LacZ为模式抗原,对其免疫小鼠后特异性抗体水平、细胞免疫水平和细胞因子水平进行比较和分析。结果：3种不同类型的CpG序列在体内能够不同程度地增强免疫小鼠的特异性抗体水平和细胞免疫水平,并且不同类型的CpG序列可能具有不同的免疫调节作用。结论：作为内源性佐剂,CpG免疫刺激DNA序列可不同程度地提高模式抗原特异性的免疫反应,可根据不同抗原的特点加以利用。     

免疫佐剂CpG DNA的研究进展

CpG DNA存在广泛的免疫效应,其免疫效应有赖于DNA中的模体,同时具有种属特异性和细胞特异性。CpG DNA的作用机制目前还不很清楚,但此方面的研究导致了许多新的发现,目前CpG DNA已有了多方面的应用。     

一类潜在的新型佐剂--含CpG基序的寡核苷酸

DNA是生命的遗传物质,已是不可争论的事实,可是DNA作为信号分子的观点就不容易被理解.相继有文献报道了细菌DNA,而非脊椎动物DNA,具有免疫激活的效果[1-4].含有CpG基序的寡核苷酸(ODN)具有以下免疫效果:诱导B细胞增殖、分化,免疫球蛋白诱生和分泌,抗诱生的细胞凋亡[5,6];诱导单核细胞分泌IL-12以及其他的细胞因子[7,8];并且活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌[2,4,9-11].研究人员推测:针对CpG ODN所产生的迅速的免疫激活反应,可能是由于宿主识别微生物分子特异的结构模式,而唤醒了机体先天性的免疫保护机制.由于CpG ODN特异的免疫激活机制,引起了研究人员的极大兴趣,取得了许多新的研究进展,显示出CpG ODN作为一类新型的免疫佐剂的潜在可能性.     

纳米级壳寡糖/DNA复合物的制备和性能研究

同甲壳素和壳聚糖这种生物大分子相比,壳寡糖具有许多独特的功能性质,如水溶性、保湿性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促进性等。以数均分子量为5000的壳寡糖作为研究模型,根据凝胶电泳和紫外光谱分析,提出纳米级壳寡糖与pEGFPC-1质粒能通过静电结合或物理包裹形成复合物从而对DNA进行保护,同时证明形成壳寡糖/DNA复合物后,壳寡糖能够极大地提高DNA的贮存稳定性和结构稳定性;而DNaseI酶解实验也显示纳米级壳寡糖在合适比例下DNA有良好的保护作用,使其不被DNaseI降解,证明了纳米级壳寡糖应用于基因治疗载体的可行性与安全性。     

超电荷绿色荧光蛋白(+36GFP):一种新型生物大分子穿膜载体

超电荷绿色荧光蛋白(sc GFP)是一种表面带很高净电荷的新型功能蛋白质。ScGFP具有很强的水溶性和抗蛋白质聚集的能力,在生物技术、医药和材料科学方面有着广泛的应用前景。带正电荷的sc GFP能够穿透细胞膜,具有运载核酸和蛋白质等生物大分子进入哺乳动物细胞内的能力。与传统的转运载体相比,sc GFP有细胞毒性低、转运效率高和具广泛的细胞普适性等优点。带正电荷的sc GFP与带负电荷的核酸分子之间通过静电相互作用形成自组装的多离子复合物,这与生物体中的组蛋白和带负电荷的DNA之间自组装成染色质的行为非常相似。本文以带有36个正电荷的超电荷绿色荧光蛋白(+36GFP)为例,对超电荷蛋白的性质,细胞穿透能力以及其作为生物大分子穿透载体的应用等方面做一综述。     

基于核酸自组装纳米结构的siRNA药物递送研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为转录后调节机制,可靶向mRNA进行剪切降解从而发挥基因沉默效应.siRNA (small interference RNA)因其高效性和特异性而被广泛应用于药物研究中.目前,研究者们已开发了多种阳离子载体用于siRNA递送.但由于siRNA双链结构具有相对较强的刚性结构,且阴离子电荷密度较低,无法与阳离子载体形成稳定、致密的复合物,使得siRNA的应用仍面临诸多挑战,如细胞摄取率低、靶向特异性差、递送过程不稳定、潜在的细胞毒性以及易诱发免疫反应等.近年来,核酸自组装纳米结构由于其结构灵活且负电荷密度较高而受到广泛关注,有望实现siRNA药物的高效递送和基因沉默.本文综述了近年来基于核酸自组装纳米结构的siRNA递送的研究进展及其应用.     

细胞穿透肽在白菜小孢子中的内化及其效率的探究

该研究以大白菜‘94-323’为材料,通过分析细胞穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP)在其小孢子细胞中的内化及其效率,证明了细胞穿透肽Tat2可以克服花粉壁的障碍,独自或者转导GUS酶和DNA(环型质粒DNA、线型质粒DNA)等大分子进入大白菜小孢子中;同时研究了Tat2介导的DNA在白菜小孢子中内化效率的影响因素。结果表明:内化效率与Tat2/DNA复合物和小孢子共育时间正相关,随复合物浓度的升高而增加,最适共育温度为33°C,与转导DNA片段的长度关系不明显。该研究首次证明,Tat2可以作为纳米载体传递大分子进入双子叶植物小孢子细胞,GUS酶的内化频率可达到18%,可为细胞穿透肽介导的芸薹属小孢子转基因技术的建立提供直接的实验依据。     

壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米DNA疫苗肌注BALB/c鼠诱导细胞免疫效应的研究

探讨载有日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)编码基因重组子(命名为pJME/GM-CSF)的壳聚糖纳米颗粒的免疫佐剂效应及其机制。本研究采用复凝聚法制备壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒;免疫组化法检测肌肉注射部位浸润细胞的类型,流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾脏DC表型和功能的变化;乳酸脱氢酶释放法检测CTL活性。结果显示制备的壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒鉴定正确;pJME/GM-CSF募集包括非成熟树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞到注射部位,增加脾脏树突状细胞表面MHCII的表达,抗原摄取和递呈功能,增强疫苗诱导的细胞免疫反应,壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒可进一步扩大pJME/GM-CSF的上述作用。这些结果表明壳聚糖可作为DNA疫苗肌注免疫时的传送载体,能够增强pJME/GM-CSF疫苗的细胞免疫应答。     

新型非病毒三元复合DNA载体的研究

基因治疗是未来临床医学最具潜力的治疗方式,目前阻碍临床基因治疗发展的主要因素是缺乏安全和高效的基因载体,因此研究理想的非病毒转基因载体具有重要的意义.构建了由质粒DNA(D)-抗DNA抗体(A)-阳离子脂质体(C)组成的三元复合纳米基因载体(DAC),研究表明,三组分在磷酸缓冲液中可通过分子组装形成复合纳米胶束,DAC在细胞培养中表现出显著高效的基因表达,DAC在血管平滑肌细胞中的基因转染效率比不含抗DNA抗体的二元组合(DC)高4倍,比不含阳离子脂质体的二元组合(DA)约高11倍.激光共聚焦荧光显微观察证明,DAC细胞摄取量和DNA进入细胞核的量均明显高于对照组,而DC二元组合(不含抗DNA抗体)的DNA很少进入细胞核,细胞在DAC存在下生长正常.未发现细胞毒性.研究结果提示,DAC的作用机理主要是三元复合胶束中DNA的装载量比二元载体大得多,抗DNA抗体与阳离子脂质体的协同作用明显有利于DNA被细胞摄取和胞吞,从而提高了基因的转染和表达.     

生物大分子自组装合成多维纳米生物结构与器件

生物体通过指导的自组装合成种类繁多、功能特异的天然纳米结构,它们在生命过程中扮演重要角色。按照自组装体的维度,可以分为线状(一维)、层状(二维)、笼状(三维)生物纳米结构。通过设计,这些生物大分子纳米结构可在细胞"工厂"中重组制备,且可通过合成生物学技术对其组装和功能化进行理性设计和调控,成为功能性纳米器件。这类纳米生物结构和器件已经在生物传感、催化、肿瘤热疗、药物递送、组织工程、生物电池等领域获得展示或应用。相关研究正在成为合成生物学和纳米生物学的一个交叉领域,受到关注。     

DNA纳米舱可逆开关的性质与应用

由于生物大分子的一些特殊物理、化学属性,蛋白质、核酸等一类生物分子被广泛应用于制备各种纳米结构与器件,但是基于生物分子集体动力学性质的纳米器件还没有真正开发出来。本文讨论一种在表面上自组装形成的具有可逆开关性质的DNA纳米舱结构。由于DNA杂交动力学集体行为的一些特性,此纳米舱可以对小分子进行有效的禁闭和释放,从而可能被应用于开发DNA序列检测芯片的基本元件。我们的研究表明,根据此纳米舱的工作原理制造的DNA检测器件可以探测到一个碱基对的错配,其选择性远高于传统的DNA芯片,同时检测灵敏度也有一定的提高。这个研究结果开创了发展不需要荧光标记的DNA芯片的新思路。     

斑马鱼ifn-γ基因启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器(University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browse)数据库预测斑马鱼ifn-γ基因的启动子序列并通过PromoterScan和AliBaba软件预测转录因子结合位点,运用Methprimer-Design软件预测CpG岛。之后克隆ifn-γ启动子,并构建成pGL3-ifn-γ-promoter-enhancer表达载体,经双酶切验证和测序鉴定后,通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-ifn-γ-promoter-enhancer重组载体的活性。结果显示,利用PromoterScan软件预测ifn-γ启动子上存在Promoter区,AliBaba在线分析发现该启动子上存在CRE-BP、CREB、TBP、ICSBP、C/EBP、HNF、c-Fos、TEC、Spl、AP-1、ATF、GATA、RSRFC、Oct、NF-1、c-Jun、TFIID和NF-kappaB等重要的转录因子结合位点,Methprimer-Design在线分析没有预测到CpG岛,但是其5′侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。之后将克隆的ifn-γ启动子片段构建成pGL3-ifn-y-promoter-enhancer表达载体,双酶切后显示目的片段大小和序列正确。最后,在RAW264.7和HEK293T细胞系中证实构建的报告基因载体具有启动子活性。以上结果表明,构建的斑马鱼ifn-γ基因启动子报告基因载体可为详细研究免疫蛋白的功能及其参与的免疫相关信号通路之间的调控作用提供有力的研究工具。     

自组装在多肽药物中的应用

自组装是指分子、纳米级结构材料等基本单元自发地组装成一个稳定而又紧密结构的过程。多肽可在各种非共价驱动力下自组装形成纳米纤维、纳米层状结构、胶束等不同的形貌。因多肽具有氨基酸序列明确、易于合成、便于设计等优势,多肽自组装技术成为了近年来的一个研究热点。有研究表明,对某些多肽类药物进行自组装设计或者使用自组装肽材料作为药物递送的载体,可以解决药物自身存在的半衰期短、水溶性差、生理屏障穿透率低等问题。本文重点介绍了自组装多肽的形成机制、自组装形貌、影响因素、自组装设计方法及其在生物医学领域的主要应用,为多肽的高效利用提供参考。     

转录因子AP-4基因真核表达载体构建及表达分析

本研究利用生物信息学分析AP-4与胃癌患者临床病理信息的相关性,根据GenBank中人AP-4基因cDNA序列设计并合成特异性引物,以胃癌细胞总RNA逆转录的cDNA为模板,利用高保真酶扩增AP-4基因CDS (Coding DNA sequence)序列并构建入pcDNA3.1+载体,并通过限制性内切酶酶切分析和测序法进行进一步验证;脂质体法将AP-4重组表达载体及对照pcDNA3.1+载体转染胃癌细胞,qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)和Western blotting检测分别检测AP-4在m RNA和蛋白水平的表达。生物信息学分析发现,AP-4的表达与胃癌分期及预后显著相关;酶切及测序分析表明,转录因子AP-4真核表达载体构建成功,并能够在胃癌细胞中实现转录和蛋白水平的高效表达。此研究为深入研究转录因子AP-4在胃癌等肿瘤发生发展中的作用及分子机制奠定了基础。     

CpG免疫刺激DNA序列及其在疫苗佐剂中的应用

CpG免疫刺激DNA序列（ISS）是一种新型疫苗佐剂,可不同程度地提高多种类型疫苗的抗原特异性的免疫反应。按照结构特点的不同,可将CpGISS分为3种类型。CpGISS能够刺激B细胞和浆样树突状细胞,促进机体产生Th1和前炎症细胞因子,且促进抗原呈递细胞的激活和成熟。目前已完成的临床实验结果表明,CpG作为人用佐剂安全,且在一定程度上能够增加疫苗的免疫反应。     

利用纳米材料制作多肽疫苗佐剂的思考

纳米粒子与生物体有着密切的关系,DNA/蛋白质复合体就在15～20 nm之间,多种病毒颗粒也是纳米级的超微粒子.多肽抗原需要与适当载体形成复合物才能诱导有效的免疫应答,但载体效应难以避免.纳米佐剂可以避免载体效应的发生,而且还是巨噬细胞(Mφ)、树突状细胞(DC)的首选吞噬目标.纳米化的有机药物可提高其生物利用度、制剂的均匀性、分散性和吸收性;脂质体可使药物更快地到达靶向部位,而且特异性更强.目前主要用理化的方法制作纳米材料,几乎所有的生化药品,特别是DNA药物的研究开发都可引入纳米材料,多肽疫苗的分子佐剂更是如此.     

一种溶酶体靶向的原位自组装短肽设计及抗肿瘤活性研究

肿瘤已成为威胁人类生命的一大杀手,目前主要采用手术和放、化疗等手段进行治疗,但由于放、化疗的细胞选择性差、毒副作用明显且易引起肿瘤细胞产生耐受(/药)性,不利于肿瘤的持续治疗,因此亟待研发具有定向定位优势、毒副作用低的新型靶向药物.原位自组装多肽能识别肿瘤部位的特异性高表达物质,在肿瘤部位靶向性聚集形成稳定的纳米结构,实现精准和高效治疗,有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究基于多肽原位自组装的设计理念,利用溶酶体内组织蛋白酶L的催化活性,设计了靶向溶酶体且能够原位自组装的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH,研究了该分子的自组装特性及抗肿瘤活性.结果显示,在体外酸性条件下,组织蛋白酶L能精准切割Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子,其酶切产物FmocFFR-OH自组装形成长纳米纤维结构,对肿瘤细胞A375和SH-SY5Y均具有较好的杀伤作用.该分子通过靶向溶酶体杀伤肿瘤细胞且对正常细胞的毒性较低,有望成为一种新型的抗肿瘤药物.