斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。     

斑马鱼ifn-γ基因启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器(University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browse)数据库预测斑马鱼ifn-γ基因的启动子序列并通过PromoterScan和AliBaba软件预测转录因子结合位点,运用Methprimer-Design软件预测CpG岛。之后克隆ifn-γ启动子,并构建成pGL3-ifn-γ-promoter-enhancer表达载体,经双酶切验证和测序鉴定后,通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-ifn-γ-promoter-enhancer重组载体的活性。结果显示,利用PromoterScan软件预测ifn-γ启动子上存在Promoter区,AliBaba在线分析发现该启动子上存在CRE-BP、CREB、TBP、ICSBP、C/EBP、HNF、c-Fos、TEC、Spl、AP-1、ATF、GATA、RSRFC、Oct、NF-1、c-Jun、TFIID和NF-kappaB等重要的转录因子结合位点,Methprimer-Design在线分析没有预测到CpG岛,但是其5′侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。之后将克隆的ifn-γ启动子片段构建成pGL3-ifn-y-promoter-enhancer表达载体,双酶切后显示目的片段大小和序列正确。最后,在RAW264.7和HEK293T细胞系中证实构建的报告基因载体具有启动子活性。以上结果表明,构建的斑马鱼ifn-γ基因启动子报告基因载体可为详细研究免疫蛋白的功能及其参与的免疫相关信号通路之间的调控作用提供有力的研究工具。