高羊茅FaChit1基因cDNA克隆及诱导表达

应用简并RT-PCR及RACE技术,从高羊茅中克隆了1个Ⅰ类几丁质酶基因cDNA全长序列,命名为FaChit1.结果表明,该cDNA具有1个951 bp的完整编码框,编码316个氨基酸,其编码产物和其它植物的Ⅰ类几丁质酶在氨基酸序列上具有较高的同源性,包含典型的几丁质结合区、催化区以及脯氨酸、半胱氨酸富集的铰链区,但缺少定位到植物液泡所必须的C末端延伸区靶向信号.Northern杂交显示,FaChit1对真菌激发子有较强的响应,乙烯和干旱胁迫均能有效诱导FaChit1基因的表达,而对机械损伤处理的反应比较微弱,只在叶片中积累少量的mRNA.     

西伯利亚蓼几丁质酶基因Class Ⅳ的克隆及生物信息学分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库（SSH）中获得的几丁质酶（CHI）基因的部分序列,采用RACE技术克隆了具完整编码区的cDNA序列,基因全长1017bp,开放阅读框编码270个氨基酸。序列分析表明,该基因的编码蛋白（PsCHI1）以前体形式存在,N端分别有22个氨基酸的信号肽和35个氨基酸的几丁质结合域（CBD）,C端199个氨基酸为催化区（CD）,连接CBD与CD的14个氨基酸为可变交联区,成熟蛋白为不含信号肽部分,呈碱性,带正电荷。PsCHI1与所选其它植物classⅣCHI前体序列具有高度的同源性（53％-69％）,而与classⅠ和classⅡCHI的氨基酸序列同源性较低,推测为植物classⅣCHI。根据日本水稻CHI晶体结构构建了PsCHI1三维分子模型,分析显示PsCHI1可以识别比classⅠ和classⅡCHI短的几丁质片段,并以其它植物CHI的已知结构域和功能为基础,确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构,推测其可能有抗病原微生物的功能。     

植物几丁质酶的结构、基因及其表达

植物几丁质酶按其蛋白氨基酸序列结构特征及同源性可分为六类,即：ＣｌａｓｓＩ－Ⅵ。ＣｌａｓＩ在蛋白氨基酸结构上包括三个功能区域,Ｎ－端是富含半胱氨酸的几丁质结合区,约４０个氨基酸;Ｃ－端是酶的催化区,也是酶的主要功能区域,约３００个氨基酸;二者通过一个多变的交联区连接在一起。ＣｌａｓｓⅡ仅具有类似于ＣｌａｓｓⅠ的酶催化区域,而没有几丁质结合区和交联区。ＣｌａｓｓⅢ几丁质酶在氨基酸序列上与ＣｌａｓｓⅠ和Ⅱ没有任何同源性,其中有些具有几丁质酶和溶菌酶双重活性。ＣｌａｓｓⅣ类似于ＣｌａｓｓⅠ,只是在几丁质结合区和催化区缺失了少数氨基酸。ＣｌａｓｓＶ类似于ＣｌａｓｓⅠ,但具有两个重复的几丁质结合区。ＣｌａｓＶＩ与前五类几丁质酶无同源性,但与微生物几丁质酶有同源性。所有的植物几丁质酶都是由一个小的多基因族编码的,一般基因中有二个内含子,都位于催化区内。几丁质酶的表达受病原物和植物激素的诱导而表达,也与植物的发育有关。通过转几丁质酶基因的工程植株分析几丁质酶基因的启动子,已鉴定出负责几丁质酶表达的调控序列。     

美洲大蠊几丁质酶基因的原核表达及蛋白纯化

昆虫几丁质酶是昆虫几丁质代谢不可或缺的关键酶类。本研究旨在构建美洲大蠊几丁质酶Pa Cht1基因原核表达载体,纯化并鉴定Pa Cht1重组蛋白,为后续酶活等测定奠定基础。定向克隆Pa Cht1基因成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将构建成功的pET32a-Cht1重组表达质粒导入大肠埃希菌Rosetta中,分别对诱导剂IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定最佳诱导浓度和诱导时间,并对表达产物进行可溶性分析。表达产物经镍离子柱纯化后通过Western Blot鉴定。结果表明,美洲大蠊几丁质酶Pa Cht1成熟肽基因编码区长1 083 bp,编码360个氨基酸。最佳诱导浓度和诱导时间分别为0.2 mmol/L和4 h。所得重组蛋白大小约60 k D,与预期结果大小一致,重组蛋白主要以包涵体的形式存在。Western Blot鉴定重组蛋白可与6×His-tag单克隆抗体特异性结合。说明成功构建了原核表达载体pET32a-Cht1,并诱导表达获得了重组几丁质酶蛋白。     

一株Sanguibacter sp.C4产几丁质酶基因的克隆与表达

Chi58是Sanguibacter sp．strain C4产生的一种胞外几丁质酶。通过chiA的特异性PCR引物探测到菌株C4中存在几丁质酶,并将扩增到的几丁质酶基因片段（chiA-F）克隆、测序后,提交GenBank数据库进行同源性搜索。对从GenBank中获得的高同源性序列进行比对,并根据保守区域设计2对PCR引物进行嵌套PCR,扩增出Chi58基因的开放阅读框（ORF）。测序结果表明该酶的ORF由1692个核苷酸组成,编码563个氨基酸,在N端有23个氨基酸的信号肽,其成熟蛋白的分子量应为58．544kDa。对其推导氨基酸的序列分析表明Chi58与沙雷氏菌的几丁质酶（如徂）有高度同源性（88．9％-99．6％）,其结构主要包括信号肽序列、PKD结构域和18家族糖苷水解酶结构域。将该基因克隆到pET32a（＋）载体构建重组质粒pChi58,转入大肠杆菌BL-21（DE3）进行融合表达。经IPTG诱导后,可见分子量约81．1kDa的融合蛋白的表达。     

日本沼虾ITS1序列分析及SNPs位点的筛选

研究采用直接测序法,分析日本沼虾(Macrobrachium nipponense)rDNA基因内转录间隔区ITS1的DNA序列,以筛选日本沼虾SNPs位点。共分析了32个太湖水域野生日本沼虾样本,结果表明,日本沼虾ITS1序列平均长度为1749.8bp,是迄今已报道的最长的ITS1序列,A、G、T和C的平均含量分别为29.9%、28.3%、27.7%、14.0%,G+C的含量平均为42.3%。通过序列比对,共筛选出22个SNPs位点,SNPs位点出现频率为0.0126,其中9个为C/T转换(占40.91%),4个为A/G转换(占18.18%),2个为A/T颠换(占9.09%),5个为T/G颠换(占22.73%),1个为A/C颠换(占4.55%),1个A/T或C颠换(占4.55%)。日本沼虾ITS1序列的22个SNP位点中,21个位点为2个等位基因,1个位点出现了3个等位基因,为复等位基因位点。日本沼虾ITS1序列中还发现3个具有多态性的微卫星位点、1个高度变异区以及大量的缺失、插入。研究首次对日本沼虾ITS1序列进行了分析,并发现了大量的SNP位点,为日本沼虾遗传育种研究提供了新的分子标记。       

小麦条锈菌II类几丁质合成酶基因PstChsII的克隆及表达特征

摘要:【目的】克隆小麦条锈菌几丁质合成酶基因PstChsII,分析其在小麦条锈菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PstChsII的cDNA序列和基因组序列,利用不同的生物信息学软件对序列进行分析,运用实时荧光定量技术分析基因在孢子、芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PstChsII基因（Genbank登录号GQ329851）编码区存在15个内含子,开放阅读框长2727 bp,编码908个氨基酸。PstChsII蛋白C端含有7个跨膜螺旋区,N端含多个保守结构域和“QXR     

小菜蛾几丁质酶基因的克隆及表达分析

昆虫几丁质酶参与昆虫蜕皮、消化、防御及免疫等多种生理过程,在昆虫的变态和发育中发挥着重要作用。本研究采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆获得小菜蛾Plutella xylostella几丁质酶基因,命名为PxyChi。该基因开放阅读框长1677 bp,编码558个氨基酸,推测的蛋白分子量为62.03 kDa。氨基酸序列分析表明,小菜蛾几丁质酶第1-19位氨基酸为蛋白的信号肽,且该序列具有典型昆虫几丁质酶的4个保守氨基酸序列。蛋白结构域分析表明,PxyChi属于几丁质酶Group II家族。进化树分析表明:PxyChi与同属鳞翅目二化螟Chilo suppressalis的几丁质酶亲缘关系最近,为75.5%。不同发育时期的荧光定量PCR分析表明,PxyChi在小菜蛾各个发育时期的表达量不同,其中PxyChi在2、3、4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的28.22、0.76、0.50、84.83和286倍,PxyChi在成虫的表达量最高。暗示PxyChi蛋白可能参与小菜蛾蛹期旧表皮降解和成虫翅的发育等生理过程。本研究可为探索几丁质酶在小菜蛾发育中的功能提供理论依据。     

罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控和蜕皮信号通路相关基因的表达分析

蜕皮是罗氏沼虾重要的生理过程,为了探究罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控与蜕皮通路中相关基因在蜕皮周期中的表达模式,阐明罗氏沼虾蜕皮的分子调节通路。本研究测定了罗氏沼虾肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮周期内蜕皮相关酶活性（谷氨酰胺合成酶,β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶）与蜕皮激素含量,并通过RT-qPCR分析了蜕皮信号通路中Mr-ETHR、MrFTZ-F1以及RXR、ECR和MIH基因在罗氏沼虾不同蜕皮周期内的表达模式。酶活测定结果表明,谷氨酰胺合成酶在血淋巴组织中活力高于肝胰腺组织（P<0.05）;β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶在肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮前期的活力远高于蜕皮后期（P<0.05）。在肝胰腺中几丁质酶在蜕皮后期活力显著高于其他时期（P<0.05）。肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮激素含量在蜕皮间期最低,蜕皮后期达到最高,呈上升趋势。通过PCR扩增与测序验证获得了Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1基因ORF全长序列,Mr-ETHR基因ORF全长1 173 bp,编码390个氨基酸;Mr-FTZ-F1基因ORF全长为1 206 bp,编码401个氨基酸。荧光定量结果表明Mr-ETH...     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。     

昆虫几丁质合成酶及其抑制剂

几丁质合成酶(CS)是几丁质合成的关键酶,它具有3个结构域:结构域A、结构域B和结构域C,其中结构域B是催化域。根据氨基酸序列的差异,几丁质合成酶分为两类:CS-A及CS-B,分别在表皮及围食膜基质中催化合成几丁质。关于几丁质合成有2种假想模型。有多种抑制剂可以抑制几丁质的合成,其中核苷肽抗生素类及核苷磷酸类作用于CS的催化部位,是竞争性抑制剂,其它抑制剂的作用机理仍不明确。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒BamHI—J片段序列分析

报道了斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltMNPV)BamHI-J片段的序列结构。该片段定位于SpltMNPV基因组25.8-29.9图单位（msp unit）,包括4个完整的开放读码框,几丁质酶基因（chiA）的3′端部分序列和一个同源区（hr）的部分序列。4个完整的读码框包括lef-8基因,杆状病毒J结构域蛋白基因（baculovirus J domain protein gene,bjdp),ORF570和ORF165。序列分离表明：ORF570与毒蛾核型多角体病毒（Lymantria dispar MNPV）的解旋酶－2基因有31％的氨基酸同源性。ORF165为SpltMNPV特有。J结构域蛋白在其他杆状病毒基因组中尚未见报道,其氨基酸序列N端存在J结构域,推断该蛋白质具有与DnaJ蛋白类似特征。lef-8基因编码的氨基酸与已报道的杆状病毒基因组中的lef-8基因编码的氨基酸具有高的同源性,且其C端具有与其他杆状病毒LEF－8类似的保守序列CIKICGIHGQKG。     

蜜蜂几丁质酶基因(Cht 5)的生物信息学分析

本研究采用生物信息学方法,对蜜蜂几丁质酶基因(Cht 5)编码蛋白的氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、结构功能域以及空间的二级结构和三级结构等方面进行分析和预测,并构建了系统进化树。分析结果显示,蜜蜂几丁质酶基因(Cht 5)全长1 848 bp,编码537个氨基酸,属于亲水性蛋白,含有信号肽,有典型的跨膜螺旋区,二级结构主要由无规则卷曲构成。系统进化树分析结果与传统的生物学分类结果一致。实验结果可为进一步开展蜜蜂几丁质酶基因家族的功能研究和应用提供信息参考。     

苏云金杆菌entomocidus亚种几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,B t)entom oc idus亚种HD109菌株中克隆了几丁质酶基因chiA74-HD109,其序列全长为2 031 bp,编码676个氨基酸,GenBank登录号为AY455290。其编码产物与蜡状芽孢杆菌几丁质酶CHiB(AB041932)的相似性达97.9%,与B t kenyae亚种LB IT-82菌株几丁质酶chiA74(AF424979)的相似性达98.4%,与B t pak istan i亚种几丁质酶(U89796)的相似性为83.0%,与B t kurstak i亚种几丁质酶kchi(AY189740)的相似性达97.8%,与B t israe lensis亚种几丁质酶(AF526379)的相似性达96.6%,与B t几丁质酶(AY074882)的相似性达98.4%,与B t sotto亚种几丁质酶(AY129671)的相似性为97.3%。功能结构域分析显示其编码区包含信号肽、催化区、Ⅲ型粘蛋白同源区及几丁质结合区4个部分。     

苏云金芽孢杆菌chiA,chiB全基因的克隆、表达及其序列分析

以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。     

德国小蠊几丁质酶基因的克隆及表达模式分析

几丁质酶广泛存在于自然界多个物种,其主要参与蜕皮、消化、防御与免疫等多项功能。本研究采用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从德国小蠊中克隆到几丁质酶基因(Bg Chi)的c DNA全长序列(Gen Bank No:KJ789158)。Bg Chi全长为1881 bp,包含192 bp的3'非翻译区(UTR)和69 bp的5'UTR,其开放阅读框(ORF)为1620 bp,编码539个氨基酸。预测的相对分子量为59.7 k Da,理论等电点为5.0。Bg Chi具有几丁质酶典型的结构域:N-端信号肽,几丁质催化区,C-端几丁质结合区。系统进化树分析表明:Bg Chi与同翅目禾沫蝉Poophilus costalis的亲缘关系最近,为81%。组织分布表达显示,Bg Chi主要在表皮、中肠和气管组织有表达。定量PCR结果表明,Bg Chi在6龄蜕皮前表达量最高,随之下降到较低水平。本研究结果有助于提高我们对德国小蠊蜕皮发育机制的理解,也为从几丁质降解途径获取防治德国小蠊新方法奠定基础。     

致倦库蚊几丁质酶家族基因的鉴定与分析

利用生物信息学方法鉴定致倦库蚊23条几丁质酶基因,并对它们进行命名、分组,以及基因结构、蛋白结构域、蛋白理化特性和系统发育分析,随后使用q PCR方法检测Cq Cht10在致倦库蚊生长各时期的相对表达量。结果表明,致倦库蚊几丁质酶基因长度为1 360~19 218 bp,蛋白长度为353~2 681 aa,分子量为39.557~279.503 k D,等电点为4.76~8.69。它们属于GH18家族,每条几丁质酶包含信号肽区域、催化结构域、几丁质结合域和连接区域,但包含的数量不同。此外,每条几丁质酶的催化结构域均包含保守序列FDGXDLDWEYP。本研究将致倦库蚊几丁质酶划分为12组,组Ⅰ~组Ⅶ沿用早期研究的分组标准,此外将组Ⅷ更名为组Ⅸ,再新增4个分组。Cq Cht10的q PCR实验结果显示,该基因在Ⅱ龄~Ⅳ龄幼虫期呈高表达,在蛹期和成虫期呈低表达,而在卵期和Ⅰ龄幼虫期呈微量表达,此外在雌蚊和雄蚊中无显著差异表达,提示该基因与致倦库蚊的蜕皮相关,且与性别关联不大。本研究的分析结果能够为致倦库蚊几丁质酶基因的功能研究提供有价值的信息。     

两种沼虾溶菌酶基因ORF的克隆和罗氏沼虾溶菌酶基因的组织表达(英文)

分别提取罗氏沼虾和日本沼虾血细胞总RNA,RT-PCR扩增获得特异性cDNA片段,纯化后克隆到T载体上。序列测定表明所克隆的两种沼虾溶菌酶基因的开放阅读框(ORF)为477bp,共编码158个氨基酸,包括溶菌酶成熟肽140个氨基酸残基和信号肽18个氨基酸残基。同源性分析表明,罗氏沼虾和日本沼虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列高度同源,分别为99.4%和98.1%。两种沼虾溶菌酶基因的碱基序列和推测氨基酸序列与Gen-Bank上其他对虾溶菌酶的同源性达83.0%和80.0%以上。两种沼虾溶菌酶都具有c-型溶菌酶典型的两个酶活性位点(Glu51)和(Asp68),以及8个保守结构氨基酸残基Cys,且在101、106和107位上缺少Asp,因而推测本实验所克隆的两种沼虾溶菌酶基因属c-型溶菌酶基因的非钙结合亚型。以PCR法制备罗氏沼虾溶菌酶基因的生物素标记探针,斑点杂交检测感染弧菌后溶菌酶基因mRNA在各组织中的转录水平,结果表明受感染6h后在眼、肌肉、鳃、肝胰腺、肠管中的表达量均有升高,其中在肝胰腺中的表达量最高,约为对照组的560%。在不同感染时间里,肝胰腺中该基因表达量有较大的变化:感染后3h表达量最低,24h后表达量升至最高,大约为对照组的430%,48h时的表达量又有所下降,但仍明显高于对照组(约为330%)。受弧菌感染后罗氏沼虾溶菌酶基因转录的上调证明溶菌酶基因在非特异性免疫中的直接作用,同时表明肝胰腺可能在沼虾的免疫防御过程起重要作用。       

烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。     

罗氏沼虾Rab11基因cDNA克隆及其组织表达分析

为了发掘罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)免疫相关基因, 研究Rab蛋白(Ras-related proteins inbrain)在罗氏沼虾免疫应答中发挥的作用, 研究采用RACE-PCR技术克隆了罗氏沼虾Rab11基因全长cDNA序列, 记为MrRab11。全长1381 bp, 包括226 bp的5'UTR, 511 bp的3'UTR和645 bp的开放阅读框, 编码214个氨基酸, 含有一个Rab结构域。氨基酸序列比对显示, 罗氏沼虾与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、蚤状溞(Daphniapulex)、叶蝉(Homalodisca vitripennis) Rab11一致性分别为82%、83%和82%。软件预测, MrRab11编码的蛋白分子量约为23.75 kD, 等电点约为5.34。实时荧光定量表达分析表明, MrRab11基因在罗氏沼虾各组织中都有表达, 肝胰腺中的表达量最高, 其次是肌肉和肠道。在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)感染12h后, 罗氏沼虾肝胰腺中MrRab11的表达量上升, 显著高于对照组(P0.05), 推测这是MrRab11对阴沟肠杆菌的应激表达,MrRab11在肝胰腺中参与了罗氏沼虾免疫应答过程。