固定化生长酵母连续生产酒精的研究中间试验报告

造粒器与柱式生物反应器成—封闭系统,采用正交试验确定的最适固定化条件,以海藻酸钙凝胶法进行细胞固定化,连续造粒,在反应器中完成固定化。固定化酵母在反应器中通气培养20小时左右,凝胶球细胞数达2×10~9/me,其增长速度比传统工艺自然细胞快10倍。固定化生长细胞用于生物反应器连续发酵甜菜糖蜜酒精,酒精生产能力为22.1—23.67g/L凝胶球/小时,为传统工艺酒精生产能力的10倍。停留时间为3小时。反应器系统由两个0.7KL柱式反应器和1个0.8KL成熟醪接收器组成。发酵周期由传统工艺的20小时左右,缩短为4小时,酒精含量为8.5—9.0％(V/V),对1.2号反应器的动态变化及其在发酵中的作用进行了系统研究,糖蜜中可发酵糖75％的转化是在1号反应器中完成的。     

高产天冬氨酸酶的大肠杆菌细胞的固定化

用聚乙烯醇凝胶包埋具有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌(Escherichia coli)No.1细胞。该酶的表现活力高达1638 00u／g湿细胞,酶活力的回收率为97．5％。固定化细胞和游离细胞天冬氨酸酶的最适pH均为8．0,最适温度分别为40—45℃和40—55℃。二价金属离子Mn2+、Mg2+、Ca2+和Fe2+对热钝化的天冬氨酸酶活力具有保护作用。在37—45℃下,两种细胞的热稳定性相同。二者在pH6．0的柠檬酸缓冲液中比较稳定。固定化细胞在1mol／L、pH8．0的底物溶液(内含Mn2+1mmol／L)中于4℃冰箱保存6个月,天冬氨酸酶的活力保持不变。用固定化细胞柱连续生产L-天冬氨酸,底物转化为产物的转化率达95％以上;产物的总 收率为91．1％。固定化细胞柱连续运转40天,天冬氨酸酶活力仍保持最初酶活力的90％。     

应用生物反应器连续培养基因重组CHO细胞的研究

应用5L生物反应器悬浮培养乙肝重组DNA转化的CHO细胞B43株生产HBsAg。试验了细胞接种量、微载体的加入方式、培养方法(半流加培养和连续灌流名养)对细胞生长形态和HBsAg分泌的影响,初步建立了5L生物反应器的生产工艺,在5L生物反应器最适合连续灌流培养的条件是pH 7．30—7．40,Do 25～3;％,T 36．5℃,微载体6～8g／L,灌流速度5．5—7．5L,24h细胞连续培养60天,细胞密度维持在5．O×10　6～1．O×10　7／ml之间,收获细胞液的RPHA效价为l：512—1：1024．HlBsAg含量为3－5mg／I。     

谷氨酸与Aβ对小鼠大脑层层细胞毒性的研究

目的：研究谷氨酸和Aβ对神经细胞的毒性。方法：用改良的NM-2A培养基于24孔板和盖玻片上37℃5％的CO2培养箱中培养ICR胎鼠大脑皮层细胞,用1mmol／L、5mmol／L、10mmol／L剂量的谷氨酸处理细胞30min后再于37℃、5％CO2培养箱培养24h,用20μmol／L的Aβ37℃、5％CO2培养箱中处理细胞24h;用MTT法检测细胞成活率,用PI-hochest 33342核双染色法分析细胞成活率。结果：谷氨酸和Aβ对神经细胞有毒性作用。谷氨酸的毒性呈剂量依赖性,随谷氨酸浓度的增加细胞成活率降低;Aβ20μmol/L时引起细胞死亡,成活率为对照的69．8％。结论：谷氨酸和Aβ在一定的剂量下能引起神经细胞死亡。     

内循环气升式生物反应器培养甘草细胞

自行设计研制了７Ｌ,９Ｌ及２５Ｌ内循环气升式生物反应器,并应用于甘草细胞的放大培养研究。在接种量为８％（Ｗ／Ｖ）通气率为０．２—０．２５ｖｖｍ的条件下,甘草细胞在反应器中生长迅速。其中在９Ｌ反应器中生长最好,最高生物量达１６．２５ｇ／Ｌ,生长速率达０．９ｇ／Ｌ．ｄ,均高于摇瓶培养。培养过程中ｐＨ值、溶氧状况通过电极自动显示记录,说明设计的气升式生物反应器适合于甘草细胞的大规模培养。     

固定化原生质体产谷氨酸脱氢酶的研究

本文报道了用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化谷氨酸捧杆菌T6—13原生质体及其用于生产谷氨酸脱氢酶(GDH,E．C．1．4．1．4)的研究。在一定条件下游离细胞和固定化细胞胞内可积累谷氨酸脱氢酶,但并不分泌到胞外。对数生长前期的细胞经蛋清溶菌酶处理14h后分离得到原生质体,游离原生质体和固定化原生质体可产胞外GDH。用3％海藻酸钙凝胶包埋10%的原生质体制备的固定化原生质体具有较高的产酶性,分批培养72h后发酵液中GDH活力可达到1．64×10^-2u／ml,为游离细胞胞内产酶的205％。固定化原生质体可用溶菌酶处理固定化细胞而制得,与直接固定化原生质体制备的固定化原生质体具有同样的产酶能力,且制备方便。固定化原生质体可重复使用6批次(约18天),且具有良好的贮藏稳定性。     

固定化诺卡氏菌细胞生产L(+)酒石酸的研究

用明胶包埋酒石酸诺卡氏菌(Nocardia tartaricans SWl3—57)得到顺式环氧琥珀酸开环水解酶活力较高的固定化细胞。固定化细胞的最适温度为30～45℃,而游离细胞的最适温度为35～45℃。两者的最适pH均为8．0～9．0,固定化细胞的表观米氏常数Km为0．256mol／L,而游离细胞有底物抑制作用,在底物浓度小于0．45mol／L时Km为0．246mol／L。用固定化细胞装柱(y=100ml),pH8．S,温度37℃,稀释速率D=0．25h^-1,以0．5mol／L浓度顺式环氧琥珀酸钠溶液为底物,连续运转53d,平均产L(+)酒石酸66．95g／L,克分子转化率为92．09％,反应器生产能力达到16．58g／L·h。     

固定化生长酵母连续生产酒精的研究

采用固定化生长细胞方法,以柱式生物反应器连续发酵甜菜糖蜜酒精。酒精能力为39.45g/L凝胶/h,停留时间1.8小时。生物反应器具有良好的稳定性,连续工作50天,发酵醪酒精含量在8.5％(v/v)以上。系统研究了最适固定化条件,用L_(16)(4~5)正交试验确定了最佳发酵条件。     

化学-酶法制备L-高苯丙氨酸

以苯丙酸乙酯为原料,通过正交设计优化2-氧4-苯基丁酸盐的制备条件：苯丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比为1：3,缩合反应时间为2．5h,H2SO4质量分数为20％,水解反应时间为15h,优化条件下2-氧-4-苯基丁酸盐的产率为68．24％。随后,利用E．coli A5所产的天冬氨酸转氨酶为生物催化剂制备L-高笨丙氨酸。酶转化反应的最适条件为：游离细胞体系pH、温度、底物质量浓度和细胞质量浓度分别为8．5、37℃、20g/L和30g／L;而固定化细胞体系则分别为7．0—9．0、40℃、10g／L和30g/L。采用廉价的L-谷氨酸（L—Glu）作为氨基供体,添加表面活性剂有利于提高L-HPA产率。通过研究固定化细胞转化反应进程,结果发现8h内90％的底物可转化为L—HPA。     

用连续发酵工艺由味精废液制取单细胞蛋白

用谷氨酸发酵液经一步冷冻等电法提取后的废液生产饲料酵母,经15m3气升式反应器连续发酵试验,其菌体干物质浓度平均为24．88g／L,稀释率0.187h-1,生产干酵母能力为4．65kg／m3·h,发酵单位电耗2．872kW·h／m3,生产成本在1700元,吨(饲料酵母)左右。饲料酵母粗蛋白含量在60％以上,18种氨基酸齐全,氨基酸总量达50％,达到部颁一级饲料酵母的标准。味精废液经酵母菌处理后,COD去除率74．7％。经试验统计,每开废液中获得1g菌体干物质需消耗COD 1625mg／L。     

产菊糖酶克鲁维酵母Y-85的固定化研究

把产菊糖酶的克鲁维酵母Ｙ—８５细胞固定于不同的载体上,如：脱乙酰几丁质、聚乙烯醇—海藻酸钠、琼脂、海藻酸钠、明胶等,进行连续发酵以生产高果糖浆。经过对凝胶的机械强度、固定化细胞的最适作用条件及稳定性、酶活保留率和制作工艺等综合比较,确认明胶是较好的载体。分批反应１０批次,固定化细胞酶活力及机械强度保持良好,底物转化率在９０％左右;以菊糖浓度３．２％的菊芋粉抽提液过反应柱进行连续反应,在稀释率Ｄ为０．４４ｈ－１时,其还原糖生产力为１２．５ｇ／ｌ·ｈ,转化率９２％。５５℃条件下,连续反应３０ｄ后,底物转化率由起初９４％降至８２％,酶活力只损失１２％。     

固定化假丝酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯的合成

比较了14种不同来源的脂肪酶催化油酸油醇酯的合成。其中,假丝酵母(Candidasp．)1619脂肪酶酯化能力最强,以硅藻土为载体,分别按0．1％添加椰子油、吐温80．按l％添加MgSO43种共固定物,醇化反应初速度提高了1．5倍。此固定化酶催化油酸油醇酯合成的最适温度为30℃,0～60℃下反应24h的酯化率均在90％以上,100℃下还有10．25％的酯化率。最适酯化pH6．0。反应中去水,可使终酯化率提高到99％。在添加的23种有机溶剂中,以异辛烷促进酯化的效果最好．正壬烷和正己烷次之。此固定化酶在28℃下批式重复反应的半衰期为990h,柱式固定床反应器中28℃连续运转1000h后酯化率为78％。     

大孔树脂吸附法提纯苦楝素的研究

研究了大孔树脂吸附法从苦楝树皮的提取液中提纯苦楝素的工艺条件及参数,并筛选出较为理想的大孔吸附树脂。研究结果表明,S-8型吸附树脂的静态饱和吸附量明显大于AB-8型和NKA-9型。该树脂吸附提纯苦楝素的优化吸附条件为吸附温度40℃,溶液pH值8．0,上柱液质量浓度9．127mg／mL,溶液流速2BV／h;优化的解吸条件为：洗脱剂为70％乙醇-水溶液,溶液流速1BV／h,洗脱剂用量为8倍量树脂体积。在优化条件下,可以得到含量达75．2％的苦楝素提取物,表明S-8树脂对苦楝素有良好的吸附选择性。     

生物法制备γ-氨基丁酸过程中细胞的转化特性研究

利用含谷氨酸脱羧酶的细胞转化味精制备γ-氨基丁酸,并测试了该细胞的转化特性。结果显示该细胞最适反应温度为44℃,最适反应pH为4. 6;反应体系中细胞浓度越高,损失的转化活力越低。此外,对反应体系施加外源的真空度,可使细胞转化活力有所提高。5-磷酸吡哆醛是该细胞的必要辅因子,L-谷氨酸可以代替味精作为底物被利用转化成γ-氨基丁酸。     

细胞分裂素的混合抗体型免疫亲和柱的制备与应用

内源细胞分裂素可以分成三组：异戊烯基腺苷组（ｉＰＡｓ）、玉米素核苷组（ＺＲｓ）、二氢玉米素核苷组（ＤＨＺＲｓ）。从这三组分别选ｉＰＡ、ＺＲ、ＤＨＺＲ为半抗原合成免疫原,获得的三种免抗血清基本上只识别相应组的细胞分裂素。将经初纯化的三种抗血清偶联到ＣＮＢｒ活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上制成免疫亲和柱。在其中的一根柱床高２．１ｃｍ、体积３．５５ｍｌ、直径１．５ｃｍ的亲和柱上,在流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、８０％冷甲醇为洗脱剂的条件下测得该柱容量为３．６—４．０μｇ、回收率达９３．９％～９８．３％。用该柱对丝瓜茎木质部伤流中细胞分裂素进行了纯化．表明能够用此柱对植物粗提液中的细胞分裂素进行快速分离纯化。     

应用固定化里氏木霉糖化玉米秆纤维素的研究

采用多孔聚酯材料固定里氏木霉（TrichodermareeseiRutC30）菌丝细胞,将固定化细胞在生长限制条件下重复分批培养,使纤维酶的合成与玉米秆纤维原料的酶解糖化耦合在一个反应器中同时进行。在30℃、初始pH4.8、摇瓶转速150r／min的条件下,连续重复进行12次分批培养试验。每批玉米秆用量为60g／L,培养周期4．5d,共54d。培养液中含滤纸酶活力平均为0.70IU／ml,还原糖26．41g／L,糖化率达到理论值的89.11％。固定化菌丝形态正常,菌量保持在10g／L左右。在间歇添料条件下,玉米秆原料的总量可提高到120g／L,7d后还原糖浓度达52.81g／L,糖化率为89．20％。利用固定化里氏木霉同时产酶和糖化植物纤维原料,工艺简便、成本低廉、易于连续自动化操作,是一条有效利用可再生纤维素资源的新途径。     

双载体固定化细胞的脱色研究*

将PVA包埋的细菌细胞涂布并固定于作为多孔载体的棉布上,进行染色废水的脱色试验。制备固定化细胞的条件为,细胞浓度20mg湿重/ml,PVA浓度5%,涂布量0.3ml/cm~2,饱阳硼酸液固定12小时,再用含染料的缓冲液活化细胞的脱色能力,可获得脱色能力较好的固定化细胞。在装填固定化细胞的反应柱中,分别用连续和间歇进水两种运行方式进行脱色效率的比较。在20天内,二者脱色率均在90%以上,尔后连续进水方式的脱色率下降,60天后脱色率仅为60%左右,而间歇进水方式仍能达到80%。后者的脱色效果明显高于前者。     

固定化细胞技术发酵玉米醪生产酒精的研究

本文报导了固定化酵母(S.cerevisiae 9064)批次发酵玉米醪生产酒精的研究。采用自制“多层分隔式生物反应器”在最适发酵条件下,成熟醪的终酒精浓度达10％(V/V)左右,发酵时间可由传统发酵的72h缩短到22h左右,酒精生产力提高了3倍。在吨级反应器连续运转试验时,固定化增殖酵母细胞活性稳定性可持续半年以上,PVA—凝胶粒的机械强度和弹性等以及醪液中酒精含量基本保持不变。     

固定化酵母细胞生产1,6-二磷酸果糖研究

本文研究了固定化酵母细胞制备果糖1,6二磷酸(FDP)的方法及其生产。用卡拉胶包埋方法固定化酿酒酵母(Sacchromyces cerevisae),对含葡萄糖1.0M,磷酸盐0.8M的糖磷液,pH6.5,在37℃下进行磷酸化反应。反复分批转化20天以上,可达到平均产FDPH_427.58mg/ml,最高为59.94mg/ml。用100ml固定化细胞生物反应器连续运转309h,稀释速率D=0.097h~(-1),平均产FDPH_4 21.51mg/ml。20L反应器连续运转,生产能力达到1.7g/h.L。用层析方法制备FDPNa_3结晶粉,提取收率为72.08％,制备质量达到或超过了国内外同类产品的质量要求。     

缺氧对大鼠大脑皮层星形胶质细胞Inos Mrna表达的影响

目的：观察缺氧和谷氨酸对星形胶质细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS)mRNA表达的影响,探讨大脑星形胶质细胞在缺氧性脑血管扩张反应中的作用。方法：取新生Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞原代、传代培养,分为四组：（1）对照组;（2）谷氨酸组;（3）缺氧组;（4）缺氧＋谷氨酸组。每一组包括5个时相点：0h、3h、6h、12h、24h(以缺氧后开始记时）。于（2）和（4）组加入100μmol/Lr L-谷氨酸。（3）和（4）组用95％N2／5％CO2的混合气体缺氧。提取总RNA,用RT－PCR技术检测iNOS mRNA的表达量。结果：对照组和谷氨酸组各时相点未见星形胶质细胞iNOS mRNA表达。缺氧组与缺氧＋谷氨酸组iNOSmRNA于6h开始显著增高,以后更为显著（24h内）。缺氧＋谷氨酸组iNOSmRNA表达的幅度显著高于缺氧组。结论：缺氧及缺氧＋谷氨酸可使iNOSmRNA表达增强,后者催化合成一氧化氮,作用于脑血管平滑肌,可能是缺氧性脑血管扩张的重要机制之一。