印楝素A和印楝素B对棉铃虫生长发育的影响

为了明确印楝素A和印楝素B生物活性的差异,选用印楝素A和印楝素B对棉铃虫生长发育的影响进行了比较研究。结果表明:印楝素A和印楝素B对棉铃虫3龄幼虫具有良好的拒食活性,5μg/mL处理48 h对棉铃虫3龄幼虫的拒食率分别为85.17%和69.02%。分别用含有药剂(1μg/mL)的饲料饲喂棉铃虫5龄幼虫,结果表明:印楝素A和印楝素B能够明显抑制棉铃虫5龄幼虫的体重增长,处理14 d后幼虫的体重分别下降50.28%和43.08%,仅有少量个体化蛹,化蛹率分别为26.67%和13.33%。进一步的羽化结果表明:经印楝素A和印楝素B处理的虫蛹均未能完成羽化。综合各阶段试验结果来看,印楝素A和印楝素B的生物活性存在差异,印楝素B对棉铃虫生长发育的抑制作用高于印楝素A。     

印楝素A对粉纹夜蛾Hi-5细胞的毒性机理

利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni Hübner卵细胞系（Hi-5细胞系）在细胞水平研究了印楝素(azadirachtin) A杀卵活性的毒性机理。以MTT法研究了印楝素A对粉纹夜蛾Hi-5细胞的生长抑制率,结果表明最初两天印楝素 A对Hi-5细胞无较明显活性,但随后几天抑制率显著增加。用Giemsa染色法对细胞进行染色,观察细胞形态发生的变化,发现：1.25 μg/mL印楝素 A处理Hi-5细胞1 d后,细胞已无法贴壁,形状变圆,接着细胞形态变得极不规则,有凋亡小体出现。用Ho33342染料对Hi-5细胞核DNA染色,通过荧光显微镜观察发现：经印楝素A处理后第1天,部分细胞核染色体发生异常凝聚,此后异常细胞核比例增多,核膜严重破损。以异硫氰酸荧光素(FITC)荧光染料研究了Hi-5细胞的蛋白质含量变化,发现1.25 μg/mL印楝素A 处理Hi-5细胞1 d后,细胞蛋白质指数(DI)为1.070±0.018,至第3 d DI值上升到1.912±0.019。分析了印楝素A处理后Hi-5的还原性谷胱甘肽(GSH)的相对含量变化,发现1.25 μg/mL处理浓度下,各天处理组GSH抑制率有显著差异。结果显示印楝素A能够抑制Hi-5细胞增殖,影响细胞骨架正常功能,降低细胞活力。     

印楝油对印楝素的增效作用和保护作用

印楝油对印楝素具有增效作用,印楝素A和印楝种子石油醚抽提物和印楝种子植物油分别按1：10(m／m)混用处理斜纹夜蛾3龄幼虫,共毒系数分别为150．17和226．87,印楝素B和两者混用后的共毒系数分别为166．00和242．18。印楝种子植物油对印楝素具有保护作用,在54℃下热贮7d,印楝油(甲醇：印楝油=9-1,v／v)对印楝素A和印楝素B的保护效果分别为56．96％和50．86％;热贮14d,保护效果分别为26．72％和38．42％。     

印楝素对SL-1的细胞凋亡诱导作用

本文以喜树碱(camptothecin)作对比,以二甲基亚砜(DMSO)作对照,系统研究了印楝素（azadirachtin）对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体细胞系(SL-1)的凋亡诱导作用。印楝素0.75 μg/mL处理后SL-1细胞后12～72 h,倒置显微镜观察可见大量细胞皱缩,体积变小,胞膜气泡化,与邻周细胞脱落,胞浆浓缩,胞膜突起,细胞器密集,核染色质浓缩并凝聚在核膜周边,出现大量凋亡小体;AO染色荧光显微镜观察可见细胞核内致密明亮黄绿色荧光和亮绿色或橘黄色的凋亡小体;透射电镜观察可见细胞皱缩、微绒毛消失、染色质浓缩和边缘化、核膜皱缩界限模糊、部分线粒体嵴结构消失和数量明显增加的吞噬泡等细胞凋亡典型形态学特征;TUNEL实验可见大量被标记为小圆形或环形黄绿色或绿色荧光的阳性凋亡细胞。流式细胞仪测定表明,印楝素0.75 μg/mL处理后48 h凋亡率最高达11.45%,比对照提高381.3倍;而喜树碱以1.72 μg/mL处理亦对SL-1具有相似的诱导作用,处理后36 h凋亡率最高达到17.42%。扫描电镜观察表明,印楝素和喜树碱处理后,SL-1细胞表面没有形成明显的“孔"、“洞"、“门"之类的结构破坏。推测印楝素与喜树碱对SL-1的凋亡信号转导方式和途径不同,导致细胞凋亡时序性不同。     

印楝愈伤组织形成及其印楝素含量测定

取印楝（AzadirachtaindicaA．Juss）不同器官作外植体,研究培养基和继代次数对愈伤组织生长及其印楝素（Azadirachtin）生物合成的影响．印楝的不同器官（根、叶、茎及皮）均能诱导出愈伤组织,这些愈伤组织均有合成印楝素的能力．其中以叶诱导的愈伤组织生长速率及印楝素含量为最高．含有较低按盐的B5培养基有利于细胞生长,含有较高铵盐的MS培养基有利于印楝素积累,不含铰盐的White培养基对两者均不利．愈伤组织继代2—3代,有利于愈伤组织生长和印楝素合成。     

印楝愈伤组织开矿及其印楝素含量测定

取印楝不同器官作外植体,研究培养基和继代次数对愈伤组织生长及其印楝素生物合成的影响。印楝的不同器官（根、叶、茎及皮）均能诱导出愈伤组织,这些愈伤组织均有合成印楝素的能力。其中以叶诱导的愈伤组织生长速率及印楝素含量为最高。含有较低铵盐的Ｂ５培养基有利于细胞生长,含有较高铵盐的ＭＳ培养基有利于印楝素积累,不含铵盐的Ｗｈｉｔｅ培养基对两者均不利。愈伤组织继代２－３代,有利于愈伤组织生长和印楝素合成。     

印楝素对亚洲玉米螟幼虫生长发育的影响

本文报道印楝素对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guene幼虫生长发育的抑制作用和引起幼虫各器官的病变症状。用含20ppm印楝素的人工饲料饲喂亚洲玉米螟3—4龄幼虫2天,然后换入正常饲料,可使幼虫期显著延长,最后不能化蛹而死亡。印楝素对幼虫的作用是缓慢的,虫体受药后还可发育一个龄期。处理幼虫的行为失常,取食动作逐渐消失,主要靠消耗体内的水分和脂肪来维持生命。幼虫的胸足变黑,胸部出现褐色斑,这些部位的表皮分层不正常,真皮细胞坏死或自溶。处理幼虫的大脑萎缩,生殖器官和前胸腺肿大,前胸腺细胞膜厚而松散,血淋巴中β-蜕皮酮含量显著降低。从整个中毒症状来看,印楝素可能作用于亚洲玉米螟幼虫的神经和内分泌系统,从而逐渐引起各器官的病变。     

C12-水解印楝素A的制备、结构鉴定及生物活性

C12-水解印楝素A是将印楝素A C12位上的-COOCH3水解为-COOH而得到的印楝素衍生物。处理后24h和48h,C12-水解印楝素A对斜纹夜蛾3龄幼虫AFC50分别为3．44μg／mL和6．89μg／mL。处理后48h,3μg／mL C12-水解印楝素A对小菜蛾3龄幼虫的拒食率为73．59％,5μg／mL C12-水解印楝素A对棉铃虫3龄幼虫的拒食率为67．76％。3μg／mL C12-水解印楝素A处理后72h,小菜蛾3龄幼虫的校正死亡率为78．16％;5μg／mL C12-水解印楝素A处理后72h,棉铃虫3龄幼虫的校正死亡率为58．69％。     

印楝素乳油对荔枝蒂蛀虫种群的控制作用

利用生命表的方法和干扰作用控制指数评价了印楝素乳油对荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensisBradley种群的控制作用,结果表明:0.3%印楝素乳油对荔枝蒂蛀虫成虫显著的产卵忌避作用是其对该种群控制的主要机理。在室内,0.3%印楝素乳油在6 mL/L和3 mL/L的浓度处理下,对荔枝蒂蛀虫成虫产卵的忌避率分别为89.3%和86.3%。田间的试验结果表明,在印楝素乳油浓度为6 mL/L和和3 mL/L的处理区中,荔枝蒂蛀虫的种群趋势指数分别为1.23和1.45,显著低于对照区的种群趋势指数11.60,干扰作用控制指数分别为0.106和0.112。这2个浓度的印楝素乳油对荔枝蒂蛀虫种群的控制效果分别可达89.4%和87.5%。     

树干注射印楝素的动态研究

本文主要以雪橙Citrus sinensis（um）Osbeckcv．Xue Cheng为研究对象,研究了成年雪橙树对印楝素药液的吸收速率,印楝素注射雪橙树后在雪橙叶片中的富集和消解动态,结果显示：采用药水吸收系数评价雪橙树对印楝索水溶液的吸收速率和日平均吸药量的试验结果表明,雪橙树对印楝素水溶液的吸收速度在不同时间存在明显差异,以14时至15时为吸药量最高点,吸收值为35．8mL／h,该时段也是试验当天最高温度时段。日平均累积吸药量为221．8mL,药水系数为2．98。不同浓度印楝素注射雪橙树后,在叶片中的富集量和消解动态一致。印楝素富集量在注射后9一lO天达到了峰值,注射后56天各注射浓度的雪橙树叶片中仍能检测到印楝素,而印楝素喷雾处理的雪橙树植株的叶片在药后7天即无检测量。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

印楝素乳油对斜纹夜蛾的生物活性及田间防效研究

在室内测定了印楝素乳油对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)的生物活性,并进行了田间防治试验.结果表明,印楝素乳油对斜纹夜蛾具有多种生物活性,主要表现在对幼虫的拒食作用、生长发育的抑制作用和一定的毒杀活性,以及对成虫产卵的忌避作用.经印楝素处理后,幼虫平均发育历期延长、幼虫体重、蛹重、化蛹率和蛹羽化率显著低于对照,印楝素乳油12μl·L^-1浓度处理3龄幼虫5和7d后的体重分别是对照组的36.8%和14.5%,而幼虫平均发育历期比对照组延长6d左右,化蛹率和蛹羽化率分别是27.79%和37.23%,显著低于对照组85.66%和82.11%.印楝素对低龄幼虫有一定的毒杀活性,而对高龄幼虫活性则很低.田间防治试验表明,印楝素乳油对斜纹夜蛾种群有良好的控制作用,施药7d后其防治效果要优于化学农药10%除尽悬浮剂.     

Differential cytotoxic effects of azadirachtin on Spodoptera frugiperda and mouse cultured cells

Azadirachtin is a natural biopesticide extracted from the neem tree (Azadirachta indica); however, its safety to mammals is not well documented. This study examined the influence of azadirachtin on the proliferation and morphology of Spodoptera frugiperda insect cells (SF-9), and mouse erythroleukemia cells (MEL-GM 86). Cell kinetic studies conducted at 24 h intervals for 144 h showed that azadirachtin treatments (0.05, 0.20 and 0.50 g/ml) inhibited cell multiplication of the SF-9 cells. This inhibitory effect was dose dependent. Conversely, azadirachtin at 30 g/ml did not reduce MEL-GM 86 cell proliferation. SF- 9 cells displayed an increase in cell swelling and cell abnormalities after 48 h of treatment with azadirachtin, whereas no such changes were detected in MEL-GM 86 cells. A scanning electron microscope study revealed that treatment with an azadirachtin concentration as low as 0.10 g/ml induced cell swelling and caused distortions on the cell surface ultrastructure of SF-9 cells characterized by blebbing and holes after 48 h of treatment. However, these effects were not seen in the azadirachtin-treated MEL- GM 86 cells.     

虫酰肼及其衍生物0593对家蚕的毒性及作用机理

为明确虫酰肼衍生物0593对家蚕Bombyx mori的毒性,本研究采用食下毒叶法测定了虫酰肼及其衍生物0593对家蚕的毒性,观察了亚致死浓度下对家蚕生长发育的影响,并测定了虫酰肼及其衍生物0593对家蚕幼虫体内保护酶的影响,对虫酰肼0593的作用机理进行了初步探索。结果表明：虫酰肼及其衍生物0593对2龄家蚕96 h的LC₅₀值分别为1.2863和0.3364 mg·L^-1,属高毒级药剂;虫酰肼及其衍生物0593在亚致死剂量下对家蚕的生长发育有明显的不利性,可使幼虫历期缩短0.5～2 d;处理组眠期体重、全茧量、蛹重和化蛹率与对照相比均显著降低;对4龄幼虫体内多酚氧化酶和几丁质酶也有较明显影响,虫酰肼及其衍生物0593处理家蚕,处理后6 h对体内多酚氧化酶有明显激活作用,12 h后表现出显著的抑制作用;虫酰肼及其衍生物0593对家蚕体内几丁质酶均有激活作用。0593对保护酶的影响较虫酰肼明显。结果提示虫酰肼及其衍生物0593对家蚕毒性高,对其生长发育和保护酶类均有不利性,不适合在桑园及其周边农田使用。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

杀菌剂对斜纹夜蛾SL细胞系和幼虫的生物活性

以MTT法筛选了19种杀菌剂对斜纹夜蛾Spodoptera litura SL细胞的毒杀活性,并以该方法研究了三唑类杀菌剂对SL细胞的毒力。结果表明: 福美双、烯唑醇、己唑醇、氟硅唑、苯霜灵、苯醚甲环唑、戊唑醇和腈菌唑等杀菌剂对SL细胞具有优异的毒杀活性。三唑类杀菌剂腈菌唑、烯唑醇、己唑醇和戊唑醇处理SL细胞48 h后,LC₅₀值分别为21.94 μg/mL、 23.80 μg/mL、 33.16 μg/mL和47.63 μg/mL。以考马斯亮蓝G₂₅₀法研究了腈菌唑对SL细胞中蛋白质含量和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的影响, 20 μg/mL腈菌唑处理12 h、24 h、48 h和72 h后,SL细胞中蛋白质含量分别降低8.55%、25.95%、42.95%和67.05%;处理24 h和48 h后,SL细胞的LDH漏出率分别为30.66%和32.05%。以浸叶喂食法处理斜纹夜蛾3龄幼虫,三唑类杀菌剂可显著抑制试虫体重增长。以0.5 μg/头、 1.0 μg/头和2.0 μg/头剂量的腈菌唑注射处理72 h后,斜纹夜蛾4龄幼虫血细胞数量分别降低12.31%、 25.96%和25.73%;腈菌唑注射处理48 h和72 h后,对斜纹夜蛾幼虫的LD₅₀值分别为1.59 μg/头和1.53 μg/头。结果显示以离体培养细胞为对象,从现有杀菌剂中寻找新的杀虫剂先导化合物具有良好的研究潜力。     

Angiogenic and anti-inflammatory properties of azadirachtin A improve random skin flap survival in rats

Random skin flaps are widely used to repair tissue defects. However, the distal flap regions are prone to ischemic necrosis, limiting clinical applications. Azadirachtin A, a fruit extract from the neem, improves tissue blood supply and metabolism, reduces cell swelling, promotes tissue healing, and prevents venous thrombosis. We explored whether it enhances random skin flap survival. Fifty-four Sprague-Dawley rats were divided into control, low-dose, and high-dose Azadirachtin A-treated groups using a random number table. We used an improved version of the McFarlane technique to create flaps. On day 2, superoxide dismutase and malondialdehyde levels were measured. Tissue slices prepared on day 7 were stained with hematoxylin and eosin. The expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor kappa-B (NF-kB), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were immunohistochemically assayed. Microcirculatory blood flow was measured via laser Doppler blood flowmetry. Flap angiography was performed using the lead-oxide gelatin injection technique. And the azadirachtin A groups exhibited a greater mean flap survival area, an improved mean blood vessel density, a greater blood flow, and higher superoxide dismutase and VEGF levels, especially at the high dose. Azadirachtin A markedly reduced the levels of TNF-α, IL-6, IL-1β, TLR4, and NF-kB. These findings suggest that azadirachtin A promotes random skin flap survival by improving the blood supply, reducing tissue inflammation, and inhibiting flap ischemia reperfusion injury.     

Recombinant protein synthesis in Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4 insect cell aggregates.

The Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4 (Tn-5B1-4) insect cell line has received considerable attention as a host for the baculovirus expression vector system. In the present study, suspension cultures were used to compare Tn-5B1-4 cell aggregates and cells selected to grow predominantly as individual cells. No significant difference was found between cell aggregates and cells growing predominantly individually in regard to cell growth rate, glucose consumption and lactate accumulation, and specific recombinant protein synthesis levels. In addition, the levels of recombinant protein synthesis were considerably higher than those produced by the commonly used Spodoptera frugiperda Sf-9 insect cell line.     

暗期干扰对环带锦斑蛾滞育诱导的影响

在短日照条件下,环带锦斑蛾Pseudopidorus fasciata以4龄幼虫进入冬季滞育,其滞育诱导的临界暗长为10.5 h。本文系统测试了暗期干扰实验［即在暗期采用单一的光（亦称光脉冲）干扰光周期反应的实验］对环带锦斑蛾幼虫滞育的抑制影响。幼虫孵化后在25℃,短日照L9∶D15(光9 h∶暗15 h),L10∶D14、L11∶D13及L12∶D12暗期的不同时段给予1 h或30 min光脉冲干扰。结果表明： 滞育是否被抑制主要取决于暗期的长度,当光脉冲干扰前的暗长（D₁）或光脉冲干扰后的暗长（D₂）超过临界暗长（10.5 h）时,100%的幼虫被诱导进入滞育;当D₁和D₂都短于（或等于）临界暗长时,滞育不同程度被抑制,抑制的效果则取决于所干扰的光周期、光脉冲的长度和光脉冲落入的位点。结果说明该虫滞育诱导的暗期干扰反应是基于临界暗长的时间测量。     

三株烟草天蛾新细胞系的生长特性及重组蛋白表达

从尚未涉及的昆虫种类中建立新的细胞系能为基础研究和生物技术应用提供重要资源。本实验通过细胞培养技术, 建立了3株来源于鳞翅目昆虫烟草天蛾Manduca sexta卵组织的新细胞系, 分别命名为QB-Ms1-8, QB-Ms2-2和QB-Ms2-7。这3株细胞已经培养在TNM-FH培养基中, 28℃条件下传代培养了约50代, 大部分细胞呈梭形, 细胞群体倍增时间分别为51, 31和49 h。虽然这3株细胞系对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV）不够敏感, 侵染后96 h感染率在33%~40%之间, 但是QB-Ms2-2细胞与BTI-Tn5B1-4细胞比较, 分泌型碱性磷酸酶（SEAP）活性表达更高。本研究从建立的3株烟草天蛾新细胞系中筛选出SEAP高表达的细胞系QB-Ms2-2, 为进一步细胞克隆和筛选提供了新资源。