基于GST-pull down的小G蛋白Rac1活性检测体系的建立

目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-PBD融合蛋白,并通过GST-pull down实验评估该方法的特异性和准确性。结果:pGEX-PBD质粒构建成功;纯化得到的GST-PBD融合蛋白能够特异性地与激活形式的Rac1(GTP-Rac1)结合,并且能够准确反映血小板衍生生长因子刺激下细胞内Rac1的激活过程。结论:GST-PBD融合蛋白及其整套GST-pull down检测体系能方便有效地检测细胞内Rac1的活性。     

人源Plk1及其结构域蛋白的融合表达及纯化

目的:表达纯化GST-Plk1及GST-Plk1 KD、GST-Plk1 PBD融合蛋白,以用于Plk1与其结合蛋白相互作用的研究。方法:PCR扩增Plk1全长及其KD、PBD结构域基因,定向克隆至p GEX-4T-1原核表达载体中,在大肠杆菌中分别表达其融合蛋白,并利用GSH交联的琼脂糖珠纯化。结果:人源Plk1及其结构域基因被克隆至p GEX-4T-1载体中;通过亲和纯化获得带有GST标签的Plk1及其结构域的融合蛋白。结论:构建了GST-Plk1、GST-Plk1 KD、GST-Plk1 PBD表达质粒并表达了相应的融合蛋白,为研究Plk1体外相互作用蛋白提供了基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ED)和胞内激酶结构域(PKD)的原核表达载体,获得纯化的GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增EGFR的ED和PKD基因编码序列,将其正确插入p GEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose4B珠子纯化融合蛋白。结果:构建得到GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,经Western印迹检测,融合蛋白成功表达;纯化得到融合蛋白GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD。结论:克隆了GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD基因,并获得了活性良好的GST-EGFR-ED和GST-EGF-PKD融合蛋白,为研究EGFR在肿瘤中的作用奠定了实验基础。     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

融合蛋白CBD-SPA“Z”基因的构建、表达与活性鉴定

针对金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)层析柱的应用问题,将SPA的Z结构域基因与纤维素结合结构域(CBD)重组,并在Z结构域C端引入1个半胱氨酸(Cys),构建并表达出一种新型免疫亲和材料。利用基因工程技术将质粒pEZZ18中的Z基因插入到含有CBD的质粒pET35b(+)质粒中,构建出原核表达载体pET35b(+)-ZCys,经IPTG诱导表达,获得CBD-Protein Z融合表达蛋白。pET35b(+)-Z-Cys在E.coli BL21中正确表达,所表达的融合蛋白具有与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性和与纤维素结合的活性。结果证明CBD-Protein Z蛋白具有Z结构域与CBD结构域的活性,预计能在免疫亲和层析中用于IgG抗体的纯化。     

骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性测定

目的:用大肠杆菌表达骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽,经分离纯化后检测其生物学活性.方法:运用基因重组技术,将骨桥蛋白RGD黏附序列的核酸片段首尾相连,与携带GST编码序列的原核表达载体连接构建融合蛋白表达质粒pGEX-3X-RGD.将重组质粒转化宿主菌后,对诱导融合蛋白表达的条件进行优化.表达产物GST-RGD经谷胱甘肽-亲和层析纯化后,分别检测其对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移的影响.结果:所构建的含有6个拷贝短肽的GST-RGD融合蛋白可在大肠杆菌中以包含体的形式进行表达.用十二烷基肌氨酸钠变性溶解包含体及透析复性后,经亲和层析可得到高纯度的GST-RGD(6)融合蛋白.GST-RGD(6)融合蛋白能特异性的抑制骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞的黏附和迁移.结论:骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽可在大肠杆菌中高效表达,纯化的GST-RGD融合蛋白具有抑制血管平滑肌细胞黏附和迁移的活性.     

MLP增强生肌素对nAChRγ亚基基因启动子的结合活性

构建表达GAL4 MLP融合蛋白的真核表达质粒pBind MLP .哺乳动物细胞双杂交试验表明 ,MLP与生肌素E12复合物存在细胞内的相互作用 .构建表达GST融合蛋白GST MLP和GST E12的原核表达质粒pGEX 2TK MLP以及pGEX 4T 2 E12 .在E .coliBL2 1中诱导表达GST MLP、GST 生肌素和GST E12 ,并用亲和层析法纯化了这 3种GST融合蛋白 .这 3种GST融合蛋白进行的凝胶阻滞试验表明 ,MLP可以增强生肌素 E12复合物对AChRγ亚基基因启动子的结合活性 .研究初步阐明了MLP增强nAChRγ亚基基因启动子在分化C2C12细胞中的转录活性的分子机制 .     

人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人14-3-3σ基因的原核表达载体,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列,将其克隆到pGEX-KG载体中,重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达,采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果:从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序与目的基因序列完全一致;在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52 000的目的蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功,并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白;通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合,并证实其具有生物学活性。结论:获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白,为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。