中华大蟾蜍卵母细胞质膜存在钙依赖性的氯离子通道

本文采用双微电极电压钳方法研究了中华大蟾蜍卵母细胞内源性电压门控型离子通道的成分及其生理特性。卵母细胞去极化至 -30 mV 及更正电压时,有一持续的电压依赖性外向电流出现。钾离子通道拮抗剂四乙基氯化氨(tetraethy-lammonium chloride, TEA, 10 mmol/L)和 4- 氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP, 10 mmol/L)协同作用时,该电流只能被抑制到最大电流幅度的(23.4±0.72)%。但是,上述浓度的TEA和4-AP 与氯离子通道拮抗剂5- 硝基-2, 3- 苯酚丙胺苯甲酸盐 (5-nitro-2,3-phenypropylamino benzoate, NPPB, 30 μmol/L)、无钙 Ringer 氏液或钙离子通道拮抗剂维拉帕米(40 μmol/L)协同作用时,可分别将此外向电流抑制到最大电流幅度的(2.1±0.08)%、(2.2±0.04)% 和(3.1±0.15)%。结果表明,中华大蟾蜍卵母细胞质膜上除有钾离子电流之外,还存在钙依赖性的氯离子电流。     

非洲爪蟾卵母细胞GABA_B和GABA_C受体介导的电流反应

实验应用双电极电压箝技术 ,在具有滤泡膜的非洲爪蟾 (Xenopuslaevis)卵母细胞上记录到γ 氨基丁酸(γ aminobutyricacid ,GABA) 激活电流。此GABA 激活电流的特点及有关GABA受体类型的研究和分析如下 :( 1)在 3 5 5 % ( 5 5 / 15 5 )的受检细胞外加GABA可引起一慢的浓度依赖性的外向电流。 ( 2 )GABAA 受体的选择性拮抗剂bicuculline ( 10 -5mol/L)对GABA ( 10 -5mol/L)引起的外向电流无阻断作用 (n =6)。 ( 3 )GABAB 受体的选择性拮抗剂2 hydroxysaclofen ( 10 -4mol/L)能将GABA ( 10 -5mol/L)引起的外向电流可逆性地转变为内向电流 ,后者又可被GABAC 受体的选择性拮抗剂I4AA ( 10 -5mol/L)所消除 (n =6)。 ( 4 )GABAB 受体的特异性激动剂baclofen可引起部分 ( 2 0 % ,12 / 60 )受检细胞产生一慢的浓度依赖性的外向电流。 3× 10 -6 、3× 10 -5及 3× 10 -4mol/L 2 hydroxysaclofen分别阻断baclofen ( 10 -5mol/L) 激活电流 ( 6 3± 3 2 ) % ,( 4 4 1± 2 2 ) %及 ( 86 0± 1 6) % (n =6)。 ( 5 )baclofen激活电流的I V曲线显示逆转电位在 - 96 8± 7 2mV左右 ,此电流可分别被TEA ( 5mmol/L)和BaCl2 ( 2mmol/L)所阻断。以上结果提示 :在非洲爪蟾的卵母细胞上存在内源性GABAB 和GABAC 受体 ,GA     

大鼠脑mRNA在爪蟾卵母细胞内表达的电压门控钙通道的电压箝研究

本工作用电压箝记录方法研究了爪蟾卵母细胞经注射大鼠脑mRNA后表达的电压门控钙通道。钙通道的特性由通过钙通道的钡离子流(I_(Ba))来描述。本研究采用的卵母细胞均取自被鉴定的爪蟾。这些爪蟾卵母细胞内源性I_(Ba)大多为零,或小于15nA。将从出生后10d的大鼠全脑中提取的mRNA微量注入这些卵母细胞。在注射mRNA后的5d内,I_(Ba)逐渐增大。在mRNA注射后第三天,由大鼠脑mRNA表达的电压依赖性I_(Ba)最大值一般超过100nA。作为对比,在注射从胚胎大鼠脑提取的mRNA的卵母细胞,几乎测不到电压依赖性I_(Ba)的表达。我们研究了由大鼠脑mRNA表达的I_(Ba)的电压依赖性激活及失活特性和I_(Ba)的药理。发现镧系金属离子(La~(+3),Nd~(+3),Sm~(+3),Eu~(+3),Gd~(+3),Dy~(+3),Er~(+3)在微摩尔浓度数量级即能有效抑制I_(Ba)。L-型钙通道配体nifedipine和Bay K 8644在浓度100μmmol/L时,抑制I_(Ba),而另一dihydropyridine类配体(±)-nimodipine在相同浓度却增加I_(Ba)。     

去甲肾上腺素、乙酰胆碱对绵羊心肌浦肯野纤维瞬时性内向离子流的影响

用电压箝制术观察了去甲肾上腺素、乙酰胆碱对绵羊浦肯野纤维由乙酰毒毛旋花子甙元诱发的瞬时性内向离子流(I_Ti)的效应。当乙酰毒毛旋花子甙元浓度为4.5×10~(-8)mol/L 时,诱发出的I_(T1)稳定并能维持约1.5h。去甲肾上腺素1.5×10~(-6)mol/L,可使I_(Ti)的峰值由11.4±2.5nA 增加到14.5±4.1nA(n=11,P相似文献   

非洲爪蟾卵母细胞GABAB和GABAc受体介导的电流反应

实验应用双电极电压箝技术,在具有滤泡膜的非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞上记录到γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)-激活电流。此GABA-激活电流的特点及有关GABA受体类型的研究和分析如下(1)在35.5%(55/155)的受检细胞外加GABA可引起一慢的浓度依赖性的外向电流。(2)GABAA受体的选择性拮抗剂bicuculline(10     

霉菌毒素 Dihydroxyaflavinine 非竞争性抑制在爪蟾卵母细胞内表达的 GABA_A 受体通道

Dihydroxyaflavinine 是黄曲霉菌(Aspergillus flavus)的吲哚类代谢物。我们将鸡脑mRNA 注入爪蟾卵母细胞表达得到 GABA_A 受体通道,然后用电压箝记录方法定量研究了dihydroxyaflavinine 对 GABA 电流反应的作用。Dihydroxyaflavinine 非竞争性阻断GABA 电流反应(K_I=12μmol/L),撤药后反应迅速恢复。作为比较,青霉素对 GABA_A受体的抑制作用随 GABA 浓度的升高而增加。浓度高达1μmol/L 苯二氮(艹卓)位点配体 Ro 15-1788(KD=0.6—2nmol/L)不能阻断10μmol/L dihydroxyaflavinine 的作用,说明 dihy-droxyaflavinine 不作用于 GABA_A 受体的苯二氮(艹卓)位点。Dihydroxyaflavinine 类似印防已毒素,表观上加速 GABA_A 受体的脱敏过程,而青霉素和荷包牡丹碱与此相反。     

注射热损伤大鼠纹状体mRNA的爪蟾卵母细胞对多巴胺的反应

将从正常大鼠和热损伤大鼠的中枢纹状体提取的poly(A) mRNA ,注入非洲爪蟾卵母细胞表达。用电生理方法检测多巴胺诱发的膜电位和电流的变化 ,分析热损伤对中枢多巴胺受体表达的影响。结果表明 ,注射大鼠纹状体mRNA后 ,卵母细胞的静息电位与注射前没有变化 ,但多巴胺能诱发膜电流。经验证 ,此受体电流的主要载流离子是Cl-。注射热损伤大鼠纹状体mRNA的卵母细胞对多巴胺反应的敏感性降低 ,与正常大鼠组相比有显著性差异。因此可以断定 ,热损伤对大鼠纹状体中多巴胺受体的基因表达产生了明显的影响 ,并可能有离子通道的参与。     

淀粉样β蛋白和自由基对扑赡卵母细胞表达的大鼠脑谷氨酸受体功能的影响

目的探讨淀粉样β蛋白(Aβ1-40)和自由基对爪蟾卵母细胞表达的大鼠脑谷氨酸受体(GluR)功能的影响.方法采用Promega试剂盒提取3月龄大鼠脑组织总RNA和mRNA,并将50nl(50ng)的mRNA显微注射到每个爪蟾卵母细胞.注射后的卵母细胞在(19±1)℃条件下以改良的巴氏液孵育进行受体表达.这些表达的受体的激活电流采用双电极电压钳位技术记录.超氧阴离子自由基(SAFRs)和Aβ1-40于记录前12h、24h、96h分别加入孵育液.结果爪赡卵母细胞可以表达出M型ACh、谷氨酸、多巴胺、GABA和5-羟色胺受体.Aβ-40对表达的GluR有抑制效应,其程度依作用时间和浓度而异.20nmol/LAβ1-40作用24h对表达的GluR功能无影响.与SAFRs共同孵育时,20nmol/LAβ1-40作用12h即对表达的GluR功能有明显影响,60nmol/LAβ1-40作用12h即对表达的GluR有明显抑制效应(降低21%,P＜0.05),而60nmol/LAβ-40作用24h下降达52%.维生素E对这些效应有拮抗作用.结论自由基和Aβ对GluR具有抑制效应,该效应能被维生素E拮抗.Aβ可能通过抑制受体功能在AD病理生理学中起作用.     

尼氟灭酸对γ-氨基丁酸激活DRG神经元电流的作用

目的:观察尼氟灭酸(NFA)对大鼠背根神经节(DRG)神经元γ-氨基丁酸(GABA)激活电流的调制作用。方法:在新鲜分离的大鼠DRG神经元,应用全细胞膜片钳技术记录NFA和GABA激活电流。结果:部分DRG神经元(21/48,43.75%)外加NFA(0.1～100μmol/L)能引起浓度依赖性的外向电流,而大多数DRG神经元(150/159,94.32%)外加GABA(0.1～100μmol/L)则引起明显的浓度依赖性的内相电流。NFA-(100μmol/L)和GABA-(100μmol/L)激活电流的幅值分别是(0.27±0.06)nA(n=12)和(1.29±0.72)nA(n=53)。然而,预使用NFA(0.1～100μmol/L)能明显的抑制GABAA受体介导的内向电流。NFA的这一抑制作用也具有明显的浓度依赖性。但NFA没有改变GABA激活内向电流的EC50(大约30μmol/L)和翻转电位(大约-10mV)(P>0.05)。结论:预加NFA对GABA激活电流的峰值有明显的浓度依赖性的抑制作用。     

维拉帕米对三磷酸肌醇引起的大鼠肝细胞钙释放激活的钙电流的影响

目的 :观察维拉帕米 (verapamil,VP)对三磷酸肌醇 (IP3)引起的大鼠肝细胞钙释放激活的钙电流 (ICRAC)的影响。方法 :采用标准全细胞膜片钳技术。结果 :IP3 激活的ICRAC的峰电流为 (- 0 .2 6± 0 .0 8)nA(n =7) ;5 μmol/L维拉帕米对ICRAC的抑制率为 30 .9%± 7.8% (从 - 0 .2 5± 0 .10nA到 - 0 .17± 0 .0 5nA ,n =5 ,P <0 .0 1)。结果 :维拉帕米能有效抑制IP3 引起的ICRAC。     

中华大蟾蜍卵母细胞质膜的外向整流型钾离子通道

我们用电压箝方法研究了中华大蟾蜍卵母细胞的膜生理特性。发现卵母细胞膜去极化至-30mV及更偏正时,有一持续的外向电流出现,该电流与去极化程度约呈正比增加,当膜电位箝在20mV时其峰值达3.7±1.4μA。该电流被钾离子通道拮抗剂TEA和4-AP抑制,TEA半抑制浓度为2.6mmol/L。氯通道拮抗剂9-AC(2.5mmol/L)无抑制作用。无钙的或钙离子浓度增加三倍的胞外灌流液均对该电流无影响、该外向电流的逆转电位随胞外钾离子浓度的改变而变化。胞外钾离子浓度增加十倍,逆转电位约增加47.3mV,而胞外钠、钙或氯离子浓度的改变对逆转电位基本上无影响,因此该电流可被认为主要是电压依赖性钾离子流。取自冬眠蟾蜍的卵母细胞经孕酮诱发成熟后,电压依赖性钾离子流减小,仅为原来的1/20-1/30,而取自全年在高温饲养的蟾蜍的卵母细胞经孕酮处理后未见成熟,其电压依赖性钾离子流仅减小至原来的三分之一。     

胰岛素对蟾蜍卵母细胞膜电位及电解质的影响

应用普通玻璃微电极和离子选择性微电极,对正常及经过胰岛素处理的中华大蟾蜍卵母细胞膜电位、细胞内Na~+、K~+、Cl~-、H~+等活度及膜对Na~+、K~+的转运系数进行了测定。结果表明,胰岛素在促进蟾蜍卵母细胞发育成熟同时,具有使膜电位降低、细胞内Na~+、Cl~-活度增加、K~+、H~+活度减少及K~+转运系数降低等作用。胰岛素的上述作用可能与膜的通透性改变及膜上钠泵活性和Na~+/H~+交换的改变有关。     

中华大蟾蜍输卵管促受精因子的实验分析

在孕酮作用厂,切除卵巢的中华大蟾蜍输卵管上皮细胞不仅能够使外源移植的卵母细胞在输卵管中正常运行,还保证卵母细胞正常受精。根据输卵管卷曲部分泌物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,存在依赖孕酮的３３ｋＤ蛋白质。经兔抗３３ｋＤ蛋白抗体处理具输卵管分泌物的卵母细胞,受精率受到显著抑制·提示该蛋白有促受精活性。输卵管分泌物介入受精涉及复杂的多种因子。     

中华大蟾蜍卵母细胞成熟过程中膜电位变化的实验分析

The full-grown oocytes obtained from toad (bufo bufo gargarizans) submitted in hibernation state or reared at 25-30 degrees C for several months, named hibernation oocyte or high temperature oocyte, had a membrane potential of -41.51 +/- 0.77 mV and -43.83 +/- 1.39 mV in Ringer's solution respectively. The hibernation oocytes underwent GVBD (germinal vesicle breakdown) and membrane depolarization at 19 +/- 1 degree C after progesterone stimulation. The membrane potential was about -20 mV at the period of GVBD, and -10 mV or so at 20 hours after the hormone treatment. However, the high temperature oocytes did not undergo GVBD, their membrane potential decreased before the fourth hour after treatment with progesterone and then recovered. If the hibernation oocytes were preincubated at 37-38 degrees C for 13 hours prior to the culture in the medium containing progesterone (10(-6)M, 37-38 degrees C), no GVBD was observed and the membrane depolarized before the fourth hour after treatment with progesterone then recovered, but MPF was detectable in the cytoplasm (unpublished). Both GVBD and membrane depolarization appeared in the hibernation oocytes and high temperature oocytes after injection of MPF. The time required for the hibernation oocytes injected MPF to attain the membrane potential about -20 mV was 4 hours earlier than that of progesterone treatment. It was just the time required for the appearance of MPF in the cytoplasm of oocytes treated with the hormone. It was noticed in our precedent article that a factor which appeared in the cytoplasm of high temperature oocytes differed from MPF. The factor was called Hibernation Oocyte Mature Promoting Factor (HOMPF).(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

蟾蜍泛素羧基末端水解酶(tUCH)以不依赖其UCH活性的方式参与卵母细胞成熟调控

本实验室已报道中华大蟾蜍卵母细胞的p28蛋白具泛素羧基末端水解酶活性,称作tUCH,它和哺乳类中发现的UCH L1的氨基酸序列具高度同源性,二级结构同源性比较发现,二者可能具类似的功能。本文实验表明:未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞的可溶性蛋白中均含有tUCH,约占提取物中蛋白质总量的2%。根据测定所得到的GST-tUCH和GST-UCH L1对底物Ub-AMC的酶动力学参数,说明卵母细胞中tUCH可能与小鼠UCH L1有类似的生物学功能;anti-tUCH单抗可以与原核细胞表达的tUCH和显性失活突变类型tUCH C(90)S特异结合,但不识别小鼠的UCH L1。Anti-tUCH单抗能够和tUCH结合但不能封闭它的UCH活性。当anti-tUCH单抗注入卵母细胞内,则孕酮诱导的生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)过程受到抑制,足见tUCH参与GVHD调节并不依赖其UCH活性。     

蟾蜍种间核移植胚胎发育早期LDH同工酶的表现

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对中华大蟾蜍(Bufo bufo比gargarizans)与花背蟾蜍(Bufo raddei)种间核移植胚胎发育早期六个不同阶段中全胚胎的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行了分析。酶谱比较的结果表明:在正、反种间移核胚胎中,供体核LDH基因的活动开始表现于尾芽胚期;此前,杂种胚胎中LDH同工酶谱类型与受体一致。     

鸟氨酸脱羧酶参与孕酮诱导的卵成熟过程吗?

在孕酮诱导的蟾蜍卵母细胞成熟过程中,ODC活性约增加2倍。佛波酯PMA能促进孕酮诱导的成熟速度,而对ODC的活性无明显影响。精胺对ODC活性有显著的作用:当卵母细胞培养在含5mmol/L精胺的碱性任氏生理盐水(pH11.6)中时,ODC活性下降17%,而孕酮诱导的成熟速度却大为增加;当精胺注入卵母细胞后。ODC活性明显下降,而且即使孕酮诱导的ODC活性增加完全被抑制,仍有80%以上的卵母细胞发生GVBD。上述结果充分表明,ODC活性的变化不参与孕酮诱导蟾蜍卵母细胞成熟的调控过程。由于在孕酮处理的卵母细胞中,ODC活性的增加发生在精胺水平下降之后,又外源精胺能大幅度抑制卵内ODC活性,故精胺很可能是卵母细胞ODC活性的调节物。     

蟾蜍卵母细胞的Na~+/H~+交换

应用pH选择性徽电极和普通檄电极测量了蟾蜍卵母细胞内的pH值(pHi)。当用含NH_4~+而不含HCO_3~-的溶液培灌卵母细胞时,pHi逐渐下降,在停止培灌后,pHi恢复到对照值。这个pHi恢复过程是一个H~+的主动转运,用胆碱离子取代培灌液中的Na~+可以抑制pHi的恢复,这种抑制作用是可逆的。伴随着细胞内pH值的恢复,细胞内Na~+活度(Na_1~+)呈现暂时性增加,而细胞内Cl-活度(Cl_1~+)不变或稍有增加。实验结果提示在蟾蜍卵母细胞膜上存在着Na~+/H~+的交换。