γ-谷氨酰转肽酶活性电泳染色新方法

目的：建立一种新的电泳活性染色方法,以快速地对活性电泳中γ-谷氨酰转肽酶（GGT）进行显色,从而准确鉴定和定位该酶,并可用于该酶的电泳法纯化制备。方法：低温下,样品活性电泳结束后立即将浸有γ-L-谷氨酰-α-萘氨和双甘肽混合底物溶液的滤纸贴在胶面上反应5min,然后再用浸有对氨基苯磺酸和亚硝酸钠混合显色液的滤纸覆盖在基质滤纸上显色。结果：在滤纸上很快显示出一条红色条带,经切胶酶促反应检验确定为GGT,经电泳法和高效液相色谱法确定GGT达到了电泳纯。结论：该法快速、灵敏、简单、直观,为GGT的鉴定和纯化提供了一条新思路。     

Sensititre YeastOne显色药敏板与微量肉汤稀释法检测阿萨希毛孢子菌体外药物敏感性比较研究CSCD

目的以CLSI微量肉汤稀释法为参考方法,探讨商品化显色药敏板(Sensititre YeastOne)检测阿萨希毛孢子菌体外药物敏感性的临床应用价值。方法分别用微量肉汤稀释法和Sensititre YeastOne同时检测62株阿萨希毛孢子菌对临床常用7种抗真菌药物的体外敏感性,MIC值读取时间分别为24h和48h。结果微量肉汤稀释法结果显示卡泊芬净和米卡芬净对阿萨希毛孢子菌无体外活性,二者MIC90均为16μg/mL;唑类药物对阿萨希毛孢子菌体外活性较好,培养24h MIC90分别为氟康唑8μg/mL、伏立康唑0.125μg/mL、伊曲康唑0.5μg/mL;4.8%(3/62)阿萨希毛孢子菌对两性霉素B有高MIC值(4μg/mL);经24h培养,Sensititre YeastOne与微量肉汤稀释法检测阿萨希毛孢子菌对7种抗真菌药物的体外MIC一致率(essential agreement,EA)分别为氟康唑93.5%,伏立康唑98.4%,伊曲康唑98.4%,两性霉素B 98.4%,5-氟胞嘧啶88.7%,卡泊芬净100%,米卡芬净100%;培养48h后,二者检测两性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC一致率有所下降,分别为83.9%和67.7%;对微量肉汤稀释法而言,培养时间对两性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC值影响较大,24h和48hMIC一致率分别为69.4%和53.2%,对Sensititre YeastOne,MIC值明显受培养时间影响的药物仅见于5-氟胞嘧啶,24h和48h MIC一致率为11.3%,其余药物不同MIC读取时间一致率非常好。结论唑类药物对阿萨希毛孢子菌体外抗菌活性较好,Sensititre YeastOne和微量肉汤稀释法检测阿萨希毛孢子菌体外MIC值一致率较高,用于临床阿萨希毛孢子菌体外药物敏感性检测具有一定的实用价值。     

Sensititre YeastOne显色药敏板与微量肉汤稀释法检测阿萨希毛孢子菌体外药物敏感性比较研究

目的以CLSI微量肉汤稀释法为参考方法,探讨商品化显色药敏板(Sensititre YeastOne)检测阿萨希毛孢子菌体外药物敏感性的临床应用价值。方法分别用微量肉汤稀释法和Sensititre YeastOne同时检测62株阿萨希毛孢子菌对临床常用7种抗真菌药物的体外敏感性,MIC值读取时间分别为24h和48h。结果微量肉汤稀释法结果显示卡泊芬净和米卡芬净对阿萨希毛孢子菌无体外活性,二者MIC90均为16μg/mL;唑类药物对阿萨希毛孢子菌体外活性较好,培养24h MIC90分别为氟康唑8μg/mL、伏立康唑0.125μg/mL、伊曲康唑0.5μg/mL;4.8%(3/62)阿萨希毛孢子菌对两性霉素B有高MIC值(4μg/mL);经24h培养,Sensititre YeastOne与微量肉汤稀释法检测阿萨希毛孢子菌对7种抗真菌药物的体外MIC一致率(essential agreement,EA)分别为氟康唑93.5%,伏立康唑98.4%,伊曲康唑98.4%,两性霉素B 98.4%,5-氟胞嘧啶88.7%,卡泊芬净100%,米卡芬净100%;培养48h后,二者检测两性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC一致率有所下降,分别为83.9%和67.7%;对微量肉汤稀释法而言,培养时间对两性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC值影响较大,24h和48hMIC一致率分别为69.4%和53.2%,对Sensititre YeastOne,MIC值明显受培养时间影响的药物仅见于5-氟胞嘧啶,24h和48h MIC一致率为11.3%,其余药物不同MIC读取时间一致率非常好。结论唑类药物对阿萨希毛孢子菌体外抗菌活性较好,Sensititre YeastOne和微量肉汤稀释法检测阿萨希毛孢子菌体外MIC值一致率较高,用于临床阿萨希毛孢子菌体外药物敏感性检测具有一定的实用价值。     

王不留行中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分的分离和纯化

从中药王不留行中筛选具有抑制内皮细胞增殖的有效单一组分.大孔树脂吸附法进行总皂甙的分离纯化,分别收集不同浓度乙醇溶液洗脱液用SRB法进行细胞活性检测,选择有效部分用AKTA Resource柱分离,按紫外吸收峰收集洗脱液并进行活性验证,通过蒸发光散射检测组分复杂程度,选择活性高、丰度大、成份简单的峰进行C18柱分离.结果表明,王不留行提取液经大孔树脂分离和细胞活性检测发现50%～90%醇浓度洗脱液具有细胞活性,经AKTAResource柱分离得7种组份群(0～6),细胞活性测得3～6号组分有活性,选择4号组分过C18柱得5组分(A～E),B组分为有紫外吸收的主峰,但无细胞活性,其活性分布于D和E组分中,其IC50值为3.75 ug/ml,D组分经蒸发光散射检测为单峰.经上述方法分离纯化获得抑制人微血管内皮细胞增殖的单一组分群,其单一化合物具有潜在的利用价值.     

应用薄层层析技术快速检出杂色曲霉素产毒菌株

直接硅胶板薄层层析快速检出杂色曲霉素产毒菌株,简化了培养、萃取纯化等繁琐步骤,大大缩短样品检测所需时间,做到快速灵敏。检验时取生长待测菌株的琼脂块,直接以硅胶薄层板展开浸出溶液,显色后产毒株色谱带中毒素斑点清晰易辨。所用试剂、设备简单,费用低廉,容易掌握。尤其适用于大量菌株的分离筛选。应用此方法,检测了222个真菌菌株的产毒能力。     

海洋侧孢短芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌活性物质初步研究

采用滤纸片和牛津杯法对分离自大连海参养殖圈海水及海底污泥的506株细菌进行了抗菌活性筛选,获得了1株抗菌活性较强的菌株HS—A465。经形态观察及生理生化实验,结合16SrDNA序列分析,确定为海洋侧孢短芽孢杆菌（Brevribacillus laterosporus）。采用薄层层析和茚三酮显色检测,在其发酵上清液中存在2种具有较强抗菌活性的代谢物质,对每一种成分进行了分离纯化和抑菌实验。结果发现,成分2和3具有显著的抑菌作用。进一步分析表明,成分2和3还具有很强的热稳定性和pH稳定性,对有机溶剂耐受性较好。根据茚三酮显色结果,可以初步推断该活性物质结构上含有游离的氨基酸,初步推断它们是直链的肽类物质。这一研究成果将为海洋抗菌活性物质的进一步开发利用提供理论参考。     

吸水链霉菌BS-112产生的抗真菌活性物质的分离纯化与结构鉴别

【目的】分离纯化吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)BS-112产生的抗真菌活性物质,究明各活性组分的结构,测定其对黄曲霉的抑制作用,为该菌株及其产生的抗真菌活性物质的应用提供依据。【方法】通过大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析及制备HPLC等方法,对该菌株产生的抗真菌活性物质进行分离纯化;利用质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)解析各活性组分的结构;采用微量液体稀释法测定各活性组分对黄曲霉的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)。【结果】从BS-112菌株发酵液中分离获得4个抗真菌活性组分,利用波谱技术确定其结构分别为Tetrins A和B、Tetramycins A和B。96孔板法测得这4个化合物对黄曲霉的MIC分别为3.13μg/mL、12.56μg/mL、1.56μg/mL、6.25μg/mL,MFC分别为6.25μg/mL、25.0μg/mL、3.13μg/mL、12.56μg/mL。【结论】BS-112菌株产生的抗真菌活性物质由Tetrins A和B、Ttramycins A和B 4个化合物组成,它们对黄曲霉均具有良好的抑制作用。     

两种用于测定A/C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量方法的比较分析

为探索一个灵敏、简便、快速的定量检测A/C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量的方法,对两种化学法进行了分析和比较。两种化学方法分别采用间苯二酚显色法和苦味酸显色法。间苯二酚显色法为套用唾液酸测定法,苦味酸显色法是对乳制品中乳糖含量检测方法的改良。两种方法的相关系数均大于0.99,线性良好。用间苯二酚法测定样品的回收试验检测结果平均值和变异系数分别为100.4%和3.09%,用苦味酸法测定样品的回收试验检测平均值和变异系数分别为99.9%和1.43%。这两种方法可以初步应用于疫苗中乳糖含量检测。     

应用薄层层析技术快速检出杂色曲霉素产毒菌株

直接硅胶板薄层层析快速检出杂色曲霉素产毒菌株,简化了培养,萃取纯化等繁琐步骤,大大缩短样品检测所需时间,做到快速灵敏,检验时取生长待测菌株的琼脂块,直接以硅胶薄层析展开浸出溶液,显色后产毒株色谱带中毒素斑点清晰易辨,所用试剂,设备简单,费用低廉,容易掌握,尤其适用于大量菌株的分离筛选,应用此方法,检测了２２２个真菌菌株的产毒能力。     

凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)中的应用

将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)基因,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA\|32K分子较大并且表达量较高,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质,为了获得有活性的蛋白质,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法,具有成本低,效率高,并对目的蛋白质(DscuPA\|32K)进行了初步纯化等优点,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时,很值得进行推广应用。     

梯度稀释及微量点样法在环境γ-变形菌分离中的应用

[目的]细菌分离中,梯度稀释及微量点样法可较好地保持细菌的原位丰度,理论上对优势菌的分离有较高的概率;应用梯度稀释及微量点样法分离γ-变形菌是一个有趣的研究点。[方法]应用梯度稀释及微量点样法,结合不同的分离条件,对7种环境样品进行γ-变形菌分离。[结果]从7种环境样品中成功分离52株细菌,经鉴定γ-变形菌为42株,占分离细菌总数的80.77%,呈现明显的γ-变形菌偏好性;已获得的γ-变形菌分属于8个不同的属,优势菌属为Klebsiella、Enterobacter、Escherichia,占已分离γ-变形菌的78.58%。[结论]实验所应用的梯度稀释及微量点样法对γ-变形菌的分离呈明显的偏好性(P0.05),是环境γ-变形菌分离方法的重要补充,该方法适用于环境优势菌的分离尝试。     

舟山眼镜蛇毒神经生长因子的亲和层析分离

用层析和制备SDS-PAGE法纯化舟山眼镜蛇(Najanajaatra Cantor)毒神经生长因子(NGF),免疫家兔获得抗血清。用辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化IgG,蛋白A-Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,并与CNBr活化的Sepharose4B偶联,采用亲和层析法对舟山眼镜蛇毒神经生长因子进行分离纯化。产物经过SDS-PAGE检测呈一条带,并显示了良好的生物学活性。纯化NGF最大比活性为5.0×104U/mg蛋白,亲和常数为4.35×108L/mol,亲和层析分离NGF得率比传统分离方法得率提高35.2%,该方法为NGF的大量提取提供了技术支持。     

液胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体（DscuPA—32K）中的应用

将构建一种具溶栓和抗栓以重功能尿激酶原突变体（DscuPA-32K)基因,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA-32K分子较大并且表达量较高,目的的性质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质,为了获得有活性的蛋白质,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法,具有成本低,效率高,并对目的的蛋白质（DscuPA-32K)进行了初步纯化等优点,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时,很值得进行推广应用。     

用高效液相层析进行TSH-β亚单位的分离

 本文在分离纯化TSH的基础上,用高效液相排阻层析的方法成功地将THS—β亚单位与TSH—α亚单位分离开。分离的TSH—β亚单位、TSH—α亚单位与LH—α亚单位分别重组后,TSH活性得到了很好的恢复。用这种方法分离TSH—β亚单位时间短、操作简单,分离效果好,重复性好。     

临床标本中酵母样真菌的分离鉴定和药敏结果分析

目的调查目前临床标本中酵母样真菌感染现状及耐药性情况。方法常规分离临床标本中的酵母样真菌,用科玛嘉显色培养基及法国生物-梅里埃API20CAUX鉴定系统鉴定菌种,并用K—B法进行药敏试验。结果研究期间共分离到193例有临床意义的酵母样真菌,检出率较高的依次为白假丝酵母菌（62．7％）,热带假丝酵母菌（20．2％）,光滑球拟酵母菌（9．3％）。在6种抗真菌药中,对伊曲康唑、氟康唑的耐药率增高。结论近年来由酵母样真菌感染引起的疾病及其对常用抗真菌药物的耐药率有明显增加,应加强真菌的检测和耐药性监测工作,以指导临床合理使用药物。     

微型离心柱法快速分离纯化神经节苷脂

神经节苷脂的分离与纯化是研究组织细胞Gls组成、含量及代谢的基本手段.但是以往的方法周期长、溶剂用量大,为此建立了一种新的微型离心柱快速分离Gls纯化法,标准Gls的回收率为97.64％,ｎ＝7,ＣＶ＜３％,HPTLC图谱显示无丢带现象.纯化样品只需十几个小时,操作简单,溶剂用量小,重复性好,为微量样品组分的研究提供了一个有效的手段.     

单抗免疫斑点法和组织印迹法检测百合无症病毒

应用抗百合无症病毒（Lily symptomless virus,LSV）的单克隆抗体,建立了快速检测田间样品的免疫斑点法（Dot—ELISA）和组织印迹法（Tissue blot-ELISA）体系。LSV单抗稀释2,000倍时,Dot-ELISA中病叶粗汁液可被检出的最大稀释度为1：640。Tissue blot—ELISA中样品一次平切后第1次印迹与Dot—ELISA样品1：40稀释的结果相当,前4次印迹均可获得满意的显色效果。常规Tissue blot-ELISA的灵敏度低于Dot—ELISA,但用丙酮处理点过样的硝酸纤维素膜后,二者的灵敏度相当,且Tissue blot—ELISA操作更简便,适合田间大量样品的快速检测。     

日本血吸虫重感染兔肝在生理盐水中冷藏24小时后的虫卵活性观察

本文探讨日本血吸虫重感染兔肝加生理盐水置冰箱浸泡24小时后分离的虫卵活性。1材料和方法感染1500条日本血吸虫尾蚴的26只家兔肝,用常规方法分离虫卵,按兔肝湿重等分为两份。一份即时分离虫卵称即时组,另一份加少量生理盐水(淹没肝组织为度)置冰箱24小时分离虫卵称24小时组。两组所获虫卵均分别制备加热超声虫卵〔1〕和冰冻干燥虫卵。加热超声的两组虫卵用玻片法作环卵沉淀试验以观察环沉率和反应强度。冻干卵两组则制备成1%虫卵抗原用对流免疫电泳(抗原稀释法)检测活性,并用凯氏微量定氮法测含氮量,依据含氮量稀释为10—15μg/ml致敏血球,…     

真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶（aconitase,Aco）是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸. 真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1（c-Aco）和定位在线粒体的顺乌头酸酶2（m-Aco）.检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变. 顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性. 该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱. 同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.     

一种基于多种微生物的急性毒性测定方法

以广东省微生物研究所环境微生物专业菌种库中 25 个不同种属的菌株为材料, 根据菌株与有毒化合物反应的剂量效应关系、系统发育多样性以及对 2, 3, 5-三苯基四氮唑(TTC)响应稳定性的原则筛选了 10 株细菌和 1 株酵母菌作为受试菌。结合 96 孔板建立了一种稳定、灵敏的检测环境污染物急性毒性的微生物新方法, 该方法被命名为多种微生物平板毒性测试法 (Multispecies Plate for Toxicity testing, MTOXPlate)。 MTOXPlate 基于 11 个菌株菌体内脱氢酶活性, 活性大小 TTC 作为细胞活性指示, 污染物毒性由脱氢酶抑制率决定。新方法的最佳接种密度(OD600)是 1.0 稀释100 倍, 最佳指示剂 TTC 浓度为 0.1%, 最佳响应时间是 18 h, 稳定性较好, 重现性相对标准偏差 RSD <1%。用本方法测试了 7 种化合物的急性毒性, 并与 Microbial Assay for Risk Assessment(MARA)方法作了比较。结果显示: 新方法 MTOXPlate与 MARA 有非常高的相关性(r=0.978, P<0.05), 灵敏度略高于 MARA 方法。