鱼类生殖细胞

鱼类和其他大多数动物一样,胚胎发育产生两大细胞系,一个是生殖细胞系或种质系,另一个是体细胞系.生殖细胞系和体细胞系的分离发生在胚胎发育的早期,其标志是形成生殖细胞系的祖细胞,即原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs).PGC形成后从其"出生地"进行"长途跋涉"迁移到性原基,成为性原细胞,即卵原细胞和精原细胞;随后在经过配子生成的一系列发育过程后,最终产生成熟的配子——卵子和精子.生殖细胞发育的每个步骤都可能都可能影响生物个体的生殖能力或育性.巨大的生物学意义及其令人振奋的研究进展,使"生殖细胞"日益成为科学研究的热点,且作为特别议题出现在Science杂志2007年4月20日第5823期的封面上.近10年见证了对生殖细胞的认知的长足进步,这些都得益于对青鳉和斑马鱼等模式生物的研究.生殖细胞已能被准确地标记且分离以进行体外培养及移植,这为濒临绝种的动物借助近缘物种进行生殖繁衍提供了技术基础,譬如最近就有人成功地"借鲑鱼之腹"获得了虹鳟后代.另外,单倍体细胞体外培养已获成功,如最近有研究人员获得了青鳉鱼单倍体胚胎干细胞,而且把这种细胞的核移植到正常的卵子中,其能像正常精子授精一样发育并产生可育的子代.这种鱼其实最初是由嵌合卵发育而成,也就是由正常减数分裂生成的单倍体卵母细胞核和植入的体外培养的有丝分裂单倍体细胞核组成的卵.这种繁殖技术也被称作半克隆技术.这条首次获得的半克隆青鳉鱼被命名为"霍莉"(Holly).总之,本文将从基础研究和繁殖技术两方面,就生物界对鱼类生殖细胞研究和操作现状及未来研究方向进行小结与探讨.     

单倍体胚胎干细胞的获得与应用前景

单倍体细胞在遗传筛选、生物发育与辅助生殖等研究中都具有重要的应用价值。近年来,有实验室建立了哺乳动物的单倍体胚胎干细胞系,但这些单倍体胚胎干细胞是否真的具有多能性以及转基因的单倍体胚胎干细胞能否直接从细胞水平传递到动物水平,这些问题并不清楚。以自然科学基金委重大研究计划为依托,周琪实验室开展了系统的研究,获得了一系列前沿性进展:获得了具有多能性的单倍体胚胎干细胞;利用单倍体胚胎干细胞获得基因修饰动物;利用单倍体胚胎干细胞替代精、卵结合获得后代;利用单倍体胚胎干细胞进行同性生殖;利用单倍体胚胎干细胞研究物种间杂交。这一系列自主创新的研究成果推进了整个领域对单倍体胚胎干细胞的认识,大大拓展了单倍体胚胎干细胞研究的理论价值和应用前景。现主要对自然科学基金委重大研究计划中周琪实验室的原创性工作进行综述。     

用于胚胎干细胞分离培养的洋养层细胞株的建立

具有发育全能性的胚干细胞在分离培养时必须依赖滋养层细胞,本研究旨在建议一个可供使用的滋养层细胞株。本实验所建立的小鼠成纤维细胞系,已居民轩用于胚干细胞的分离培养,证明可作为分离培养胚干细胞时所需的滋养层细胞来源。     

鱼类的胚胎干细胞

胚胎干细胞(ES)是未分化的细胞培养物，来自动物的早期胚胎。它们能成为稳定的细胞系和长期冻存。在适当的条件下，ES细胞能分化成各种细胞类型，包括生殖细胞。这样，ES细胞就提供了一个有效的纽带，将动物基因组的体外和体内遗传操作连系起来。ES细胞的魅力就由其在产生和分析基因敲除老鼠中显现出来。目前，ES细胞技术仅见之老鼠，因其它脊椎动物的ES细胞的培养和建系难获成功。在鱼类，人们已做了大量的尝试。我们以青鳉(Oryzias latipes)作为建立鱼类ES细胞技术的模式，通过建立并应用无滋养层细胞的培养条件，获得了来自中期囊胚的ES细胞系。青鳉的ES细胞和老鼠的ES细胞有很多共同特征，如二倍体核型、分化潜力和形成嵌合体。因此，在鱼类建立和应用ES细胞技术是可能的。青鳉ES细胞的培养条件已成功地应用到其它鱼类如斑马鱼甚至海水鱼。本文旨在以青鳉为模式，综述获得和应用模式鱼和经济鱼ES细胞的主要进展和前景。     

单倍体干细胞研究进展

单倍体干细胞是一种全新的人工建立的细胞类型。在中国科学院"干细胞与再生医学研究"战略性科技先导专项的支持下,我国科学家在哺乳动物单倍体干细胞的建立和应用上取得了一系列重要进展,极大地丰富了单倍体干细胞类型,建立了多种新的基于单倍体干细胞的遗传修饰和辅助生殖技术,展示了单倍体干细胞可能为生殖生物学、发育生物学、遗传学和进化生物学带来的重要应用前景。主要对我国科学家在单倍体干细胞领域取得的进展进行介绍。     

用于胚胎干细胞分离培养的滋养层细胞株的建立

具有发育全能性的胚干细胞在分离培养时必须依赖滋养层细胞~［１］,本研究旨在建议一个可供使用的滋养层细胞株。将小鼠胎仔去头、内脏、四肢后用胰酶消化,用作成纤维细胞的初代培养,２～３６后继代培养,并开始进行选择和株化,获得的继代培养的成纤维细胞可用于制备胚干细胞培养所需滋养层,亦可冷冻保存备用。本实验所建立的小鼠成纤维细胞系,已成功地用于胚干细胞的分离培养,证明可作为分离培养胚干细胞时所需的滋养层细胞来源。     

哺乳动物单倍体胚胎干细胞的建立与应用

哺乳动物胚胎干细胞通常为二倍体,限制了其在后基因组时代功能基因研究上的应用.近年来,随着不同物种单倍体胚胎干细胞的建立,科学家获得了一种可用于高通量正反向遗传筛选的细胞工具.单倍体胚胎干细胞具有类似于二倍体胚胎干细胞的无限增殖能力、基因表达模式、分化潜能等特点,可以在细胞水平开展遗传筛选研究;通过不同物种单倍体干细胞的融合形成异源二倍体细胞可以用于研究基因的演化.另外,小鼠单倍体胚胎干细胞可代替配子用于产生动物,这为研究基因印记在胚胎发育过程中的作用、快速构建携带复杂基因修饰的模式动物、进行个体水平遗传筛选等提供了一个新的遗传学工具.最近,单倍体胚胎干细胞的基因组标签计划的提出,以构建所有编码蛋白质基因的标签小鼠资源平台为目的,将促进蛋白质研究的标准化,并为揭开胚胎发育复杂而有序的蛋白质调控网络提供工具.     

单倍体胚胎干细胞研究进展及思考

哺乳动物胚胎干细胞通常为二倍体,这一特性影响其在遗传筛选中的应用。近几年,科学家在单倍体胚胎干细胞(haploid embryonic stem cells,ha ESCs)的研究领域取得突破性进展。单倍体胚胎干细胞只含有一套染色体,但其克隆形态、增殖能力、基因表达模式、分化潜能等与二倍体的干细胞相似。单倍体的特点使其在正向遗传和反向遗传、生物发育以及辅助生殖等研究中具有重要的应用价值。该文从单倍体胚胎干细胞的获得、特点、进展、应用等方面进行了综述,并对单倍体胚胎干细胞研究中遇到的问题进行了思考。     

Xist敲降可以改善孤雄单倍体囊胚质量

单倍体胚胎干细胞研究一直以来吸引着研究者们的注意,它可以用作基因修饰的工具或是用于药物筛选。随着孤雄胚胎干细胞系的成功建立,更扩展了单倍体胚胎干细胞的应用前景。但单倍体孤雄胚胎发育率低,胚胎质量差,制约着孤雄单倍体胚胎干细胞的建系。为改善孤雄单倍体胚胎发育潜能及胚胎干细胞建系效率低的问题,我们检测了小鼠(Mus musculus domesticus)孤雄单倍体胚胎的体外发育过程和该过程中Xist基因表达情况。结果发现,孤雄单倍体胚胎囊胚发育率只有10%~14%,发育至囊胚所需时间差异较大,从3.5~5.5 d不等。通过核糖核酸荧光原位杂交实验(RNA-FISH)跟踪Xist基因表达情况,发现其在发育至囊胚阶段的胚胎中呈抑制状态,而在早期胚胎中多呈表达状态。通过si RNA扰低Xist表达,虽然没有改变孤雄单倍体胚胎发育到囊胚的比例,但显著提高了囊胚质量,并提高了接种胚胎内细胞团(ICM)后建立细胞系的效率。结果说明,Xist基因的表达可能是导致小鼠孤雄单倍体胚胎质量差、干细胞建系率低的原因之一。     

小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定

目的:探讨建立合适的小鼠孤雌胚胎干细胞建系方法。方法:采用氯化锶联合细胞松弛素B激活B6D2F1杂交小鼠卵母细胞,所获得的囊胚与桑椹胚分别用于孤雌胚胎干细胞的建系,观察两者的建系成功率。结果:共建立了12株小鼠孤雌胚胎干细胞系,这些细胞SSEA-1抗原阳性,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60表面抗原阴性,具有AKP活性,保持正常染色体核型,体内外分化分别形成畸胎瘤和拟胚体。结论:采用囊胚和去透明带的桑葚胚建立孤雌胚胎干细胞系获得成功。该方法为人类纯合子的胚胎干细胞建系提供基础,在自体细胞治疗领域中具有潜在的应用价值。     

成体干细胞的性别与疗效有关

干细胞与性别有关.根据一项新研究,取自雌性小鼠的肌肉干细胞用来修复损伤组织要比雄性小鼠的好.这是首次表明,干细胞的再生能力与性别有依赖关系.通常研究者并不专门用文件证明他们用来研究的干细胞系是取自雄性还是雌性.科学家如果仅考虑应用干细胞的一种性别,难免得出有偏见的结果.研究者开始考虑所应用的干细胞的性别作用.因为研究者认识到,多年来所应用的干细胞系都是选择其再生能力好的,而这些干细胞都是取自雌性.为分别研究干细胞雌雄性别的影响,研究者培养了来自15个雌性小鼠与10个雄性小鼠的健康肌肉组织的干细胞系.取自成熟动物组织的肌肉干细胞不象胚胎干细胞那样,会引起很多争论,而且可以不用杀死动物便提取出来.研究者将肌肉干细胞插入罹患类似人类肌肉营养障碍疾病的小鼠体内.两星期后,研究者计数由干细胞产生的健康肌肉纤维.只有1个雄性小鼠的干细胞系产生3 200多根新肌肉纤维,而却有6个雌性细胞系各产生这么多肌肉纤维.研究者在2007年4月9日的Journal of Cell Biology上作了报道.一位专司研究成体干细胞性别差异的科学家说,这是一个关于干细胞研究的新观念,说明干细胞的性别是有重要关系的.研究者说,这可以追溯到X和Y染色体上的某种差别,但其真相尚未了解.对于这种差异的真正机制可能要花几年时间去破解.在最近的研究工作中,研究者发现,某些应激反应基因在其插入的雌性干细胞中比雄性干细胞中活性更高.移植使细胞承受了应力,故研究者提示,在应激反应中性别差异很可能解释移植结果的差异.了解干细胞性别差异的机制,对于临床医师在治疗中用移植干细胞修复损伤组织时很可能有用.例如,研究者可以找到一种方法,将雌性干细胞性能改造雄性干细胞,从而提高未来疗法,即改变并重新插入男子自身干细胞疗法的成功率.     

《细胞》：小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系首次建立

中国科学院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组和徐国良研究组在一项合作研究中,首次建立了来自孤雄囊胚的单倍体胚胎干细胞系,而这些细胞保持了一定水平的雄性印记,并进一步验证这些细胞能够代替精子在注入卵母细胞后产生健康的小鼠。相关研究成果今天在线发表于国际著名学术期刊《细胞》（cen）,并被重点推荐。     

青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。     

招聘启事

<正>生化与细胞所程新研究组公开招聘博士后中国科学院生物化学与细胞生物学研究所程新研究组从事人类多能干细胞和内胚层干细胞的肝脏和胰腺定向分化及其临床应用方面的研究,主要目标是实现体外规模制备可用于移植的成熟功能性肝细胞和胰腺细胞。研究组长建立了世界首个来源于多能干细胞的人类胚层特异性干细胞系(Germ Layer-specific Stem Cells)-"内胚层干细胞系"(Endoderm Stem Cells/EP cells)。研究组详细情况及研究成果的介绍请参考:http://www.sibcb.ac.cn/PI.asp?id=150现因工作发展的需要,面向社会公开招聘博士后1名。待遇从优。     

一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用

在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低, 为了获得鱼类高效转基因细胞系, 我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞, 在28℃ DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析, 它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下, 报告基因的转染效率可以达到40%, 在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述, 研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系, 它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。     

外胚间充质干细胞在牙组织工程的应用与基因调控

用干细胞构建组织工程化牙齿是近年来口腔医学领域的研究热点,外胚间充质干细胞是目前已知牙源性干细胞的共同前体细胞,细胞的生物学特性和成牙信号分子环境是牙齿发育与再生的核心与关键,并贯穿于牙齿形成的全过程,是研究牙组织工程最具潜力的种子细胞,明确外胚间充质干细胞成牙分化能力及相关表型特征和分化特性,对进一步深入认识牙齿发育与再生机理具有重要作用。     

建立对未分化细胞特异性标记的小鼠胚胎干细胞系

构建pRex-1-EGFP表达载体,电穿孔转染小鼠ES细胞,用增强绿色荧光蛋白对起源于3．5d胚泡内细胞团的小鼠胚胎干细胞进行特异性标记,用荧光显微观察EGFP的表达以及RT-PCR方法检测Rex-1基因在未分化和分化中ES细胞中的表达情况。结果显示,EGFP基因成功转入小鼠ES细胞,并在未分化的ES细胞中高效表达;细胞开始分化后,EGFP的表达开始下降。由Rex-1基因启动子控制下的EGFP稳定表达的小鼠ES细胞系,对哺乳动物早期发育过程的研究以及对筛选能够调节上述过程的小分子化合物具有重要意义。     

“人造精子”与CRISPR-Cas

小鼠单倍体胚胎干细胞系的建立为遗传学的正反向筛选提供了一种简便而又有效的工具。除此之外,孤雄单倍体胚胎干细胞能替代精子使卵母细胞"受精"这一特性,更是实现了从细胞水平向动物水平的完美转变。无论是从制备多基因遗传操作动物模型的角度,还是在小鼠个体水平遗传筛选的层面,孤雄单倍体胚胎干细胞的出现都将为基因功能学研究带来新的生命力。然而,孤雄单倍体的"受精"能力极其有限,其产生健康半克隆小鼠的效率仅约2%,这也成为孤雄单倍体在个体水平广泛应用所面临并且亟需突破的一大瓶颈。通过正反面的实验验证,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所李劲松课题组发现,雄性印记区域H19-DMR和IG-DMR的异常去甲基化是半克隆小鼠发育异常的"祸根"。通过敲除这两个DMR,成功将半克隆小鼠的出生效率提高至20%,为利用孤雄单倍体获得多基因遗传操作动物模型提供了最根本有力的保障。最后,结合CRISPR-Cas9技术,他们创建了孤雄单倍体的sg RNA文库,并成功将此"细胞文库"转化成携带基因突变的"小鼠文库",由此创建了"个体水平"遗传筛选的新方法、新思路。     

揭开干细胞发育之谜

理论上说,从人胚胎分离的干细胞能够在实验室的适宜条件下培养出任何一种人体组织细胞,然而,从理论到实际并非一步之遥。科学家们尚未弄清是何种因素引起干细胞定向发育。不过,发育生物学家们已经找到一些影响发育的可能因素。他们在人的胚胎中分离到一个人胚干细胞系,这个细胞系不仅可以分化发育成各种组织细胞,也可以在特定的条件下不发生分化。目前,已知细胞的分化需要有细胞因子和生长因子的作用、相邻细胞或组织之间的信息交流。因此,人们能够将分离到的骨髓干细胞在一系列生长因子及调节蛋白的作用下,定向发育分化为红细胞或…     

一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用（英文）

在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低,为了获得鱼类高效转基因细胞系,我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞,在28℃DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析,它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下,报告基因的转染效率可以达到40%,在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述,研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系,它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。