青鳉干细胞及其应用

干细胞广泛存在于多细胞生物的早期胚胎和成体组织中.干细胞的多能性和易操作性使其在发育生物学和再生医学上具有巨大的研究和应用价值,如细胞发育潜能的调控、细胞命运的决定、细胞治疗等.干细胞培养是研究干细胞研究工作的基础,主要集中在小鼠、人和青鳉这3种脊椎动物上.青鳉是一种小型淡水鱼,常被用作发育生物学和生物医学研究的模式物种.本文将主要介绍青鳉干细胞系及其应用.青鳉的MES1是除小鼠以外的第一个胚干细胞系;SG3是第一个成体精原干细胞系,可以在体外形成具有运动能力的精子;HX1是首个单倍体胚干细胞系,通过核移植技术,将该单倍体细胞的细胞核移植到未受精卵细胞中,得到第一个可育的半克隆动物霍利.这些突破使青鳉毫无疑问地成为干细胞研究的理想模式.     

小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系建立

单倍体细胞,如酵母,是遗传学研究的重要工具。自然状态下存在的单倍体细胞只有结构和功能均已特化的配子,包括卵子和精子。然而卵子和精子不能在体外进行培养,因此也不能对其进行基因操作。如果能够在体外建立哺乳动物的单倍体细胞系,那将极大地促进哺乳动物遗传学及相关生命科学的研究。     

鱼类的胚胎干细胞

胚胎干细胞(ES)是未分化的细胞培养物，来自动物的早期胚胎。它们能成为稳定的细胞系和长期冻存。在适当的条件下，ES细胞能分化成各种细胞类型，包括生殖细胞。这样，ES细胞就提供了一个有效的纽带，将动物基因组的体外和体内遗传操作连系起来。ES细胞的魅力就由其在产生和分析基因敲除老鼠中显现出来。目前，ES细胞技术仅见之老鼠，因其它脊椎动物的ES细胞的培养和建系难获成功。在鱼类，人们已做了大量的尝试。我们以青鳉(Oryzias latipes)作为建立鱼类ES细胞技术的模式，通过建立并应用无滋养层细胞的培养条件，获得了来自中期囊胚的ES细胞系。青鳉的ES细胞和老鼠的ES细胞有很多共同特征，如二倍体核型、分化潜力和形成嵌合体。因此，在鱼类建立和应用ES细胞技术是可能的。青鳉ES细胞的培养条件已成功地应用到其它鱼类如斑马鱼甚至海水鱼。本文旨在以青鳉为模式，综述获得和应用模式鱼和经济鱼ES细胞的主要进展和前景。     

天然雌核发育银鲫卵子控制异源精核发育的受精学机制

作者对两性融合生殖鱼和雌核发育银鲫脱膜卵受精的精核发育进行了观察,并采用鱼类卵子无细胞系对以上两类卵质提取物体外诱导经Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ１００处理的精子及其发育进行了初步研究,结果表明在两性融合生殖型脱膜鱼卵中精核通过解凝最终形成原核,而在雌核发育的银鲫脱膜卵子中部分精核体积虽有一定程度的增加,但始终没有观察到原核的发育;在体外诱导实验中,经Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ１００处理的精子在两类卵质提取物中充分发育,都出现了类似体内原核的状态。该现象提示在银鲫卵质中存在有促使精核形成原核的因子,但在正常受精状态下,由于银鲫卵质促使精核核膜解体的功能的异常,使覆盖精子头部的核膜不能象在两性融合生殖受精卵子中进行崩解,精核进一步的原核发育受到抑制。另外,建立体外诱导系统的重要意义,在于它为研究雌核发育调控的分子学机制提供了一条有效途径。     

甜菜无融合生殖单体附加系M14花粉发生与发育的超微结构研究

运用透射电子显微镜技术,对甜菜无融合生殖单体附加系M14的小孢子发生、雄配子体发育以及相应的花药壁发育过程进行超微结构的观察研究,以阐明甜菜无融合生殖单体附加系M14花粉发生与发育超微结构特点以及花粉败育的时期和败育的细胞学特征.结果显示:(1)小孢子母细胞减数分裂正常,分裂期间细胞质具有明显的"细胞质改组"现象,主要表现在核糖体减少,质体、线粒体的结构发生规律性的变化,有利于孢子体向配子体的转变.M14减数分裂的胞质分裂为同时型,前期Ⅱ和中期Ⅱ形成"细胞器带";正常发育的花粉,小孢子分裂形成营养细胞和生殖细胞;生殖细胞脱离花粉壁,生殖细胞游离于营养细胞的细胞质中,最初具细胞壁,而后消失,且生殖细胞壁成分与花粉内壁成分相似.(2)三细胞型的成熟花粉含有一个营养细胞和两个具有尾突的精子;每个精子通过两层质膜与营养细胞隔开,含有一个大的精核,长尾突内含少量的细胞质以及纤丝状结构.(3)生殖细胞和精子中缺乏质体.(4)花粉的败育起始于小孢子,大部分受阻于单核-二细胞花粉期,其败育特征为花粉内液泡吞噬作用导致细胞器解体,绒毡层细胞过早解体或肥大生长致使营养供应受阻,可能是导致单核-二细胞花粉败育的主要细胞学原因.研究表明,白花甜菜第九号染色体的附加可能是导致M14大量花粉败育的遗传学因素.     

哺乳动物卵巢生殖干细胞研究的现状与未来

哺乳动物卵巢中是否存在卵细胞再生(neo-oogenesis)及卵巢生殖干细胞一直是生殖生物学领域的争议热点之一。传统观点认为哺乳动物雌性个体出生后不再有新的卵细胞生成,即个体出生时生殖细胞已发育到原始卵泡(primordial follicle)阶段,停留在第一次减数分裂前期的双线期(diplotene),之后卵泡池中的配子或凋亡,或重新启动发育,没有生殖干细胞通过再生来产生新的卵子补充到卵泡库中。然而,近年的研究结果发现,小鼠和人卵巢中可以分离出一类生殖细胞,它们在体外培养条件下具有增殖和自我更新的能力,移植入卵巢后可以分化形成有功能的卵细胞,从而挑战了这一传统理念。但是,生理条件下卵巢中是否也存在这样一类生殖干细胞,其生理功能如何。该文就此方面的研究现状和未来发展进行评述。     

c-fos-like蛋白在尖唇散白蚁繁殖蚁和工蚁性腺中的表达

为了探讨c-fos原癌基因在白蚁生殖品级和非生殖品级性腺发育中的作用,揭示白蚁不同品级性腺发育的调节机理,本研究运用免疫细胞化学定位方法对尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis繁殖蚁和工蚁精、卵发生过程中的c-fos蛋白表达进行了研究。结果显示：雌性繁殖蚁在末龄若虫期的卵子发生过程中有c-fos-like表达, c-fos-like免疫阳性物质定位于生长期的卵母细胞核和滤泡细胞核中;而繁殖蚁成虫的卵子发生过程中没有c-fos-like免疫阳性反应。雄性繁殖蚁在末龄若虫期时精子发生过程中没有c-fos-like表达, 而发育到成虫期有c-fos-like免疫阳性反应,阳性物质定位于精原细胞的细胞核中。工蚁精、 卵发生过程中均没有c-fos-like的表达。结果提示：c-fos在调节繁殖蚁精子和卵子发生方面有重要作用,c-fos可能通过调节精原细胞增殖参与精子的发生;在卵巢中可以直接作用于生长期的卵母细胞和滤泡细胞来调节卵子的发生。在工蚁性腺中c-fos表达缺失可能导致卵母细胞和滤泡细胞无法正常发育,精原细胞停止增殖而使精子发生处于相对抑制状态。工蚁性腺退化不育可能与c-fos没有正常表达有关。     

植物实验生殖生物学与生殖工程：现在与未来

植物实验生殖生物学是植物实验胚胎学发展的新阶段,其主要特征为操作技术水平的提高与多学科综合性研究的加强。花粉原生质体、生殖细胞、精子、胚囊、卵细胞的操作、雌雄配子体外融合、配子-体细胞杂交等,代表了当前的主要研究趋势。实验生殖生物学与基因工程相结合,开辟了植柏物生殖工程新技术领域的前景。对生殖工程的意义与内容提出了轮廓设想。     

植物实验生殖生物学与生殖细胞工程:现在与未来

植物实验生殖生物学是植物实验胚胎学发展的新阶段,其主要特征为操作技术水平的提高与多学科综合性研究的加强。花粉原生质体、生殖细胞、精子,胚囊、卵细胞的操作、雌雄配子体外融合、配子-体细胞杂交等,代表了当前的主要研究趋势。实验生殖生物学与基因工程相结合,开辟了植物生殖工程新技术领域的前景。对生殖工程的意义与内容提出了轮廓设想。     

由鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)染色体组叠加构建的 两个单性人工多倍体克隆

具有天然雌核发育的多倍体杂种鱼可防止杂种优势的分离并保持其后代的杂种优势. 由于假设诱发的多倍体鱼类的生殖模式是天然雌核发育的, 我们进行了鲤鲫杂种的多倍体诱发, 目的是描述经染色体组叠加由有性鲤鲫二倍体转化为异源三倍体及异源四倍体克隆谱系. 鲤鲫杂种产生未减数而具有两亲本染色体组杂种卵子, 未减数的雌核可与入卵的雄核融合叠加形成三倍体合子. 鲤鲫异源三倍体胚胎发育正常, 部分异源三倍体雌性个体可产生未减数的、仍保留母本的三套染色体的成熟卵子. 绝大部分鲤鲫异源人工三倍体个体的成熟卵子的雌核不与入卵的雄核融合, 具有天然雌核发育特性. 异源三倍体卵子在入卵精子的激动下由雌核发育产生全雌后代, 并形成一个单性克隆系, 后代保留异源三倍体母本的形态特征, 并靠雌核发育的生殖方式形成异源三倍体克隆系. 极少数异源三倍体个体的成熟卵子的雌核可与入卵的雄核融合, 再通过染色体组叠加形成鲤鲫异源四倍体. 所有异源四倍体的雌性产生未减数的、含有4个染色体组的成熟卵子. 异源四倍体的成熟卵子保持雌核发育特性, 在近类的精子诱发下产生单性后代, 形成一个异源四倍体单性克隆.     

青鳉(Oryzias latipes)性腺分化与发育的组织学观察

青鳉(Oryzias latipes)繁殖力强、繁殖周期短,为硬骨鱼类研究领域的模式生物。目前,尚无青鳉性腺分化与发育过程的系统资料。该文以青鳉孵化后不同时期的生殖腺为材料,经石蜡切片和HE染色后,于光学显微镜下观察其性腺的出现、分化及成熟过程。结果显示:孵化后5~10 d,仔鱼腹腔右侧已可见生殖腺,生殖细胞体积明显大于周围的体细胞;孵化后10 d,性腺开始分化,雌、雄性个体性腺出现结构上的差异,雌性个体内可明显观察到生殖包囊结构;随后,雌、雄性个体内先后可见卵子和精子的发生过程和组织学分期;孵化后50 d,首见卵巢腔结构和成熟精子。此外,还观察到性反转现象的特例,即两性特征共存的现象。该结果将为发育生物学、遗传生物学提供基础资料。     

金粉蕨配子体发育及其无配子生殖的研究

采用光学显微镜和半薄切片技术对金粉蕨(Onychium siliculosum(Desv.)C.Chr.)的配子体发育及其无配子生殖进行了研究。金粉蕨孢子黄褐色,具三裂缝,孢子萌发时先产生假根,然后长出原叶体细胞,萌发类型为书带蕨型。原叶体细胞经丝状体、片状体发育为原叶体,发育类型为水蕨型。金粉蕨配子体分枝发达,成熟配子体呈丛状。多次培养表明金粉蕨只能产生精子器,不能产生颈卵器,为专性无配子生殖。半薄切片观察表明配子体生长点下方的细胞经分裂产生一群小型细胞,由它们发育为无配子生殖胚。小型细胞先分化出无性胚芽,再分化出胚根。胚芽与胚根,胚与配子体之间由分化出的导管连接。     

卵子介导细胞重编程的基础与应用研究

细胞重编程一般是指将分化细胞转变成全能性胚胎或多能性细胞的过程,是研究发育和分化的重要手段,为再生医学、疾病个体化治疗及药物筛选等提供了巨大的应用前景。诱导细胞重编程的方法有多种,如细胞培养、卵子介导的核移植(nuclear transfer)、细胞融合、山中伸弥因子介导的诱导多能干细胞(i PSC)技术等。以国家自然科学基金重大研究计划为依托,李劲松课题组围绕着卵子介导的细胞重编程领域开展了系统的研究,取得了一系列突破性的进展:完善了卵子介导的核移植体系;建立精子和卵子来源的"类精子"的单倍体胚胎干细胞系和半克隆技术;建立人和猴子的孤雌单倍体胚胎干细胞系;卵子介导的重编程与i PSC技术比较揭示影响重编程的重要因子;建立卵子介导遗传疾病治疗的策略。现主要对卵子介导细胞重编程的基础与应用研究的原创性实验成果进行综述,并展望未来关注的重点研究方向。     

鱼类染色体转移—仙台病毒融合胚胎细胞核移植的初步研究

细胞杂交技术近二十年来取得了巨大的成 就,现已被广泛地应用于医学和生物学各个领 域[4,51。但是体细胞杂交只能得到杂交的细胞, 还不能得到杂交的个体,至少在动物界是如此。 在植物方面已经能通过原生质体的融合产生杂 交细胞,再通过杂交细胞的培养产生新的再生 植株〔2,71。而动物的繁殖只能由生殖细胞通过 胚胎发育才能产生新的个体。虽然不少人曾做 了许多尝试,想通过卵子和体细胞人工融合的 方法产生杂种,但迄今还没有成功［[8-10,1310童第 周等11,11,121在鱼类细胞核移植方面做了不少工 作,利用鱼类囊胚细胞的核,移植到不同属和不 同亚科的去核未受精成熟卵内,得到了几种核 质杂种鱼。这些工作不但证明了鱼类早期囊胚 细胞具有发育的全能性,同时也说明利用动物 早期胚胎的体细胞核育种的可能性。那么用囊 胚细胞的融合引进外来的染色体以及改造原有 细胞的遗传组分,然后把融合的囊胚细胞的核 移植到去核的未受精的成熟卵里去,是不是能 产生具有新的遗传性状的个体呢？本实验正是 基于这样的目的进行的。首先我们使用同源的 囊胚细胞融合,然后移植核,以了解：(1)鱼类 囊胚细胞融合的条件;(2)融合后的囊胚细胞核 移植是否能促使卵子发育;(3）发育的胚胎染色 体组成如何？以便为导人异源染色体创造条件。     

从生殖生理谈计划生育

生殖是动物维持其种族延续的一种自然过程。在高等动物,生殖是通过两性生殖器官的活动而实现的。基本生殖过程包括:生殖细胞(精子与卵子)的形成、交配、受精、着床以及胚胎发育(妊娠)等过程。从理论上讲,只要中断或破环这些过程的某一环节就可达到抗生育的目的。实践证明,研究生殖生理过程是发展控制生育方法的重要基础。本文从基本生殖过程简介目前正在使用或正致力于研究的抗生育措施。     

泥鳅雌核生殖单倍体胚胎发育的研究

本文研究了泥鳅雌核单倍体的胚胎发育。结果表明,单倍体的外部形态具有典型的单倍体综合症。单倍体的发育速度在眼黑色素期前与二倍体无明显差异,但此期以后则无法确定单倍体的发育时期。在水温为２２－２５℃时,单倍体至多存活１５ｄ。与正常二倍体卵黄囊吸尽期同时龄的单倍体,大多数内部器官或组织发育不良,细胞核小,但核质比与二倍体无明显差异。     

60Co-γ射线诱导鱼类雄核发育的研究

关于鱼类单倍体育种,近年来很多遗传工作者利用辐射处理的方法(6Co-r射线、X-射线、紫外线等)成功地获得了人工雌核发育鱼2-9。但直到目前为止,鱼类雄核发育的研究资料却非常罕见。本研究采用不同剂量的6Co-r射线处理几种鱼的成熟卵,再以正常精子诱发雄核发育,其结果予以报道。       

卵胎生硬骨鱼褐菖(鱼良)鲉精巢的周期发育

研究了卵胎生硬骨鱼褐菖(鱼良)鲉(Sebastiscus marmoratus)的精巢结构和生殖周期.褐菖(鱼良)鲉精巢属于小叶型.每年8～9月,精巢处于精原细胞增殖期.初级精原细胞分裂增殖,产生次级精原细胞.后者和支持细胞组成精小囊.10月～翌年1月进入精子发生期.精小囊中的生殖细胞进一步发育,逐渐形成精子.2～7月是精子退化吸收期,精巢中仅有初级精原细胞和残余的精子.在生殖季节,精子经由输出管和输精管运至尿殖突,通过体内受精方式送入雌鱼生殖道.     

青鳉的生物学特性与饲养管理技术

青鳉(Oryxias latipes)是一种小型淡水鱼类。它性极皮实,易于饲养,是研究鱼类胚胎发育、遗传变异及生理特性的好材料,也是水生毒理学的标准实验用鱼之一。本文介绍了青鳉的生物学特性,包括其基本形态,雌雄鱼的形态差别及生长、繁殖习性;在此基础上,详细介绍了青鳉的人工繁殖与不同发育阶段的饲养管理技术,有实际应用价值。     

复合四倍体异育银鲫两种不同生殖方式的细胞学观察

在复合四倍体异育银鲫（）×银鲫（）的受精过程中,精子入卵后经过解凝、核化,最终形成雄性原核,并可与卵子的雌性原核融合,证明了复合四倍体异育银鲫卵子具有与两性融合生殖极为相似的拟两性融合生殖的能力;而在复合四倍体异育银鲫（）×兴国红鲤（）的组合中,精子入卵后以固缩状态存在,又表现出典型的雌核发育型生殖行为。因此我们认为复合四倍体异育银鲫具有两种不同的生殖发育机制。此外,我们还观察到在第一次有丝分裂中期有核物质被排斥到纺锤体之外的现象。本文就复合四倍体异育银鲫生殖发育的机制进行了初步的探讨。