青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。     

利用叶绿素荧光评估草原植物羊草缺磷缺氮状况

羊草(Leymus chinensis)是北方草原的重要牧草。准确评估其营养状况,对维护羊草草原的生产力具有重要意义。以羊草幼苗为材料,利用能同时表征2个光系统光化学活性的叶绿素荧光检测技术,对缺氮和缺磷处理下的叶片光化学活性进行分析。结果表明,缺氮处理20天后羊草叶片叶绿素含量降低近50%。同期缺磷及缺氮处理对PSⅡ功能的影响总体大于PSⅠ。与对照相比,缺氮叶片的Φ(Ⅱ)和Φ(Ⅰ)分别比对照降低了30.3%与38.5%;ETR(Ⅱ)与ETR(Ⅰ)分别降低30.8%和28.9%。缺磷处理组Φ(Ⅱ)和ETR(Ⅱ)的降低幅度约为缺氮的1/2。这些定量研究结果对及时有效地诊断和区分羊草植物氮磷缺乏状况具有重要的参考价值。     

Cd2+、Cu2+胁迫对黑藻(Hydrilla verticillata)的生长及光合荧光特性的影响

以黑藻(Hydrilla verticillata)为供试材料,采用Cd2+和Cu2+等两种重金属分别在5个浓度梯度水平下的河砂水培方法,研究Cd2+或Cu2+不同浓度胁迫对黑藻株高、生物量、成活率和叶绿素含量的影响,以及对黑藻叶片最小荧光(Fo)、最大荧光(Fm),PSⅡ最大量子产率(QYmax,)、稳态下的PSⅡ反应中心关闭程度(1-Qp_Lss)、稳态下的非光化学淬灭(NPQ_Lss)等光合荧光参数及其荧光成像的影响,探讨各个参数分别随镉、铜浓度递增的变化规律。研究结果表明,Cd2+胁迫下黑藻的株高显著下降,说明Cd2+可能对黑藻叶片的维管束结构产生伤害作用;Cd2+和Cu2+胁迫对黑藻鲜重均无显著影响,说明与水生植物自由水含量存在一定关系;Cd2+和Cu2+胁迫均使黑藻干重显著下降,其中Cu2+胁迫对黑藻干重的影响更显著,说明Cu2+胁迫对黑藻累积生物量的影响远大于Cd2+;Cd2+和Cu2+胁迫下叶绿素各值均呈下降趋势,而Cu2+胁迫对叶绿素的影响更大,说明Cu2+对黑藻叶绿体的毒害比Cd2+更大。随着Cd2+或Cu2+胁迫浓度梯度的增加,黑藻的叶绿素荧光参数(Fo、Fm、QYmax)呈显著下降趋势,(1-Qp_Lss)呈上升趋势,而NPQ_Lss先上升后下降。黑藻在不同重金属胁迫下的生理指标、荧光参数及成像特征等方面所表现出的变化差异性,反映出同等浓度下黑藻受重金属胁迫的影响程度为:Cd2+胁迫Cu2+胁迫;黑藻可以在Cu2+浓度低于1 mg/L的环境下具有正常的光合活性,可推测将黑藻用于低浓度Cu污染水域的修复;在Cu2+浓度达3 mg/L以上环境下黑藻即无法长时间生存,可推测黑藻可以作为Cd污染水环境的指示种。     

饲料中添加裂殖壶菌粉对凡纳滨对虾脂质沉积和血清生化成分的影响

以健康的凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)[初重(5.810.24) g]为研究对象,研究裂殖壶菌粉(Extracted-and-dried microfungi Schizochytrium sp.,EDMS)对凡纳滨对虾脂质转运、沉积以及血清生化成分的影响。在饲料中分别添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的裂殖壶菌粉,制成5组(基础组、EMDS05、EMDS10、EMDS15、EMDS20)等氮等能饲料。将750尾健康的凡纳滨对虾随机分成5组(为每组3个平行,每个平行45尾虾),养殖时间45d。结果表明,随着饲料中DHA水平的提高,肌肉中水分、粗脂肪和粗蛋白质含量均无显著改变(P0.05),但灰分随着添加量的增加呈现上升趋势,且EMDS20组显著高于基础组和EMDS05组(P0.05);肌肉和肝胰脏中高不饱和脂肪酸(HUFA)含量显著升高(P0.05),血清总甘油三酯(TG)含量显著升高(P0.05),总胆固醇(TC)含量保持稳定(P0.05),EDMS15组高/低密度脂蛋白(HDL/LDL)显著高于其他各组(P0.05);超氧化物歧化酶(SOD)呈现先下降后升高的趋势,其中EMDS10组(1.0%添加组)显著低于其他各组(P0.05);丙二醛(MDA)含量显著升高(P0.05)。综上所述,饲料中添加EDMS促进了凡纳滨对虾肌肉中n-3 HUFA的沉积,同时也提高了虾体脂质过氧化压力。     

多维视角下天津市生态网络结构演变特征综合评价

以天津市为研究区,在构建2000、2010和2020年天津市生态网络的基础上,运用复杂网络的评价指标和景观格局指数并综合稳定性、均匀性和连通性指数,从源地-廊道-节点-整体多维度对其结构演变进行综合评价。结果表明: 2000—2020年间,天津市生态源地的萎缩退化现象严重且空间分布不均匀,生态廊道也越来越稀疏;景观破碎度和形状复杂度呈先上升后下降的态势;2000和2010年的廊道平均路径长度较短,生物流动效率相对较高;2000、2010、2020年重要度较高的节点数量分别占统计节点数量的35.7%、29.4%和21.4%;2020年的网络连通鲁棒性和脆弱鲁棒性均起伏较大且差异明显,网络稳定性最差;2010年的生态网络具有较高的连接性和较强的复杂程度,2000和2020年则较为一般;2000年的网络均匀程度最好,2010年次之,2020年最差。     

利用DNA免疫技术制备WNT16蛋白多克隆抗体

Wnt16属于非经典wnt信号途径上的一员,目前有大量的研究表明wnt16与胚胎的血液发育和骨骼发育相关。为了阐明wnt16在造血过程中的调控机制,利用RT-PCR(逆转录PCR)扩增斑马鱼wnt16基因的ORF(开放阅读框)序列全长,构建真核表达载体pCAGGS-P7/wnt16,测序正确后,用该表达载体免疫BALB/c雌鼠,进行DNA免疫,制备斑马鱼抗WNT16特异性多克隆抗体。结果表明:通过DNA免疫制备的斑马鱼抗WNT16抗血清能特异性识别WNT16蛋白。斑马鱼WNT16抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。     

甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化DNA双片段的基因敲除方法的建立

由甘蔗鞭孢堆黑粉菌Sporisorium scitamineum引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产的主要病害,严重影响了甘蔗的产量和品质,然而其分子致病机制报道很少,极大地影响了有效防控技术的开发。为了提高该病菌基因功能的研究效率,本研究以甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合两个关键基因SsGPA3和SsPRF1为目标,建立了基于DNA双片段的甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化基因敲除技术体系。结果表明甘蔗鞭孢堆黑粉菌单倍体细胞生长期在OD₆₀₀约为0.7,28℃下10mg/mL细胞壁裂解酶作用30min获得的原生质体产率最高,再生率最优;使用线性DNA双片段转化获得阳性转化子的成功率达90%以上,显著高于线性DNA单片段和质粒。本方法的建立将极大地提高甘蔗鞭孢堆黑粉菌的基因敲除效率,同时也为其他真菌的基因敲除提供借鉴。     

维生素C对细胞增殖的挽救提高shDNMT1对重编程的促进作用

在利用4个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc)获得诱导多能干细胞(iPSC)的过程中,DNA甲基化以及维生素C(Vc)发挥着重要的作用。为了研究DNMT1和维生素C在这一过程中的相互作用,在不使用Vc的情况下,利用shRNA抑制DNMT1的表达不能有效促进成纤维细胞向iPSC以及pre-iPSC向iPSC的转变。但是,在使用Vc的情况下,shDNMT1可以有效地促进这两种转变。此外,shDNMT1可以抑制成纤维细胞增殖,增大G1期细胞比例。从而在一定程度上抑制shDNMT1对iPSC获得的促进作用。而Vc则可以通过促进细胞增殖,减小G1期细胞比例,挽救shDNMT1对细胞周期的影响,进而提高shDNMT1对重编程的促进作用。     

线粒体大麻素受体1在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响

目的:探讨线粒体CB1受体(mitochondrial cannabinoid receptor1,mtCB1)在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响。方法:原代培养新生的Wistar大鼠海马神经元,将培养至第8天的海马神经元采用随机数字表分为5组(n=60):正常组(N组):正常培养,不做任何处理;缺氧复氧组(H/R组):采用氧糖剥夺法构建海马神经元缺氧复氧损伤模型,缺氧6h,复氧20 h;缺氧复氧组+ACEA+AM251组(H/R+ACEA+AM251组):缺氧6 h结束后立即加入ACEA和AM251,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+ACEA+Hemopressin(H/R+ACEA+Hemo组):缺氧6h结束后立即加入ACEA和Hemopressin,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+赋形剂组(H/R+V组):同样于缺氧6h结束后立即加入二甲基亚砜(DMSO),终浓度0.1%,复氧20 h。使用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)的浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡诱导因子(AIF)、线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1,细胞凋亡相关蛋白细胞色素C(Cytc)和Rho相关的卷曲蛋白激酶1(ROCK1)的表达。结果:与N组相比,H/R组、H/R+ACEA+AM251组、H/R+ACEA+Hemo组和H/R+V组的细胞内Ca~(2+)浓度、细胞凋亡率、以及AIF、Drp1、Fis1、Cytc、ROCK1蛋白的表达水平均明显增加(P0.05);与H/R组相比,H/R+ACEA+Hem组上述各检测指标明显降低(P0.05),H/R+ACEA+AM251组和H/R+V组各指标比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:线粒体CB1受体(mtCB1受体)可能通过降低细胞内ROS的含量来减少细胞内Ca~(2+)浓度和ROCK1的表达,进而抑制线粒体分裂,并最终减轻海马神经元缺氧复氧损伤。     

放线菌Snea253代谢产物及寡糖对南方根结线虫活性的影响

本文针对前期筛选获得的高效放线菌Snea253菌株代谢产物中杀线虫活性成分进行试管法和薄层层析法预试,结果显示活性物质含糖和氨基酸。贝氏皿浸没法研究了Snea253代谢产物中杀线虫活性物质和已知寡糖对南方根结线虫卵孵化和二龄幼虫J2的影响,结果表明:Snea253活性物质对南方根结线虫卵孵化的相对抑制率为84.95%,供试寡糖中除麦芽糖和蔗糖有不显著的抑制作用外,半乳糖、果糖和木糖显著促进了南方根结线虫卵孵化;乳糖、葡萄糖和山梨糖均具有促进作用,但与对照相比不显著。Snea253活性物质对J2的校正死亡率为98.21%,与各寡糖处理和对照相比差异显著;葡萄糖、乳糖和蔗糖处理J2无死亡现象,反而利于南方根结线虫J2的存活。研究结果显示普通寡糖对南方根结线虫基本无毒性,而放线菌Snea253代谢产物中氨基糖类物质则对线虫有毒性。