哺乳动物单倍体胚胎干细胞的建立与应用

哺乳动物胚胎干细胞通常为二倍体,限制了其在后基因组时代功能基因研究上的应用.近年来,随着不同物种单倍体胚胎干细胞的建立,科学家获得了一种可用于高通量正反向遗传筛选的细胞工具.单倍体胚胎干细胞具有类似于二倍体胚胎干细胞的无限增殖能力、基因表达模式、分化潜能等特点,可以在细胞水平开展遗传筛选研究;通过不同物种单倍体干细胞的融合形成异源二倍体细胞可以用于研究基因的演化.另外,小鼠单倍体胚胎干细胞可代替配子用于产生动物,这为研究基因印记在胚胎发育过程中的作用、快速构建携带复杂基因修饰的模式动物、进行个体水平遗传筛选等提供了一个新的遗传学工具.最近,单倍体胚胎干细胞的基因组标签计划的提出,以构建所有编码蛋白质基因的标签小鼠资源平台为目的,将促进蛋白质研究的标准化,并为揭开胚胎发育复杂而有序的蛋白质调控网络提供工具.     

单倍体胚胎干细胞的获得与应用前景

单倍体细胞在遗传筛选、生物发育与辅助生殖等研究中都具有重要的应用价值。近年来,有实验室建立了哺乳动物的单倍体胚胎干细胞系,但这些单倍体胚胎干细胞是否真的具有多能性以及转基因的单倍体胚胎干细胞能否直接从细胞水平传递到动物水平,这些问题并不清楚。以自然科学基金委重大研究计划为依托,周琪实验室开展了系统的研究,获得了一系列前沿性进展:获得了具有多能性的单倍体胚胎干细胞;利用单倍体胚胎干细胞获得基因修饰动物;利用单倍体胚胎干细胞替代精、卵结合获得后代;利用单倍体胚胎干细胞进行同性生殖;利用单倍体胚胎干细胞研究物种间杂交。这一系列自主创新的研究成果推进了整个领域对单倍体胚胎干细胞的认识,大大拓展了单倍体胚胎干细胞研究的理论价值和应用前景。现主要对自然科学基金委重大研究计划中周琪实验室的原创性工作进行综述。     

单倍体干细胞研究进展

单倍体干细胞是一种全新的人工建立的细胞类型。在中国科学院"干细胞与再生医学研究"战略性科技先导专项的支持下,我国科学家在哺乳动物单倍体干细胞的建立和应用上取得了一系列重要进展,极大地丰富了单倍体干细胞类型,建立了多种新的基于单倍体干细胞的遗传修饰和辅助生殖技术,展示了单倍体干细胞可能为生殖生物学、发育生物学、遗传学和进化生物学带来的重要应用前景。主要对我国科学家在单倍体干细胞领域取得的进展进行介绍。     

非人灵长类基因修饰模型构建技术研究进展

随着以CRISPR-Cas9为代表的新型基因编辑技术的出现及发展应用,科学家们在构建非人灵长类基因修饰模型方面取得了很多重要进展。然而,首建动物嵌合、复杂基因修饰低效、传代周期长以及遗传背景复杂等多方面因素极大地限制了非人灵长类基因修饰模型的开发和应用。现对目前非人灵长类基因编辑模型构建的进展进行综述,并重点对基因编辑技术结合体细胞核移植、精原干细胞、胚胎干细胞及单倍体干细胞等技术手段在非人灵长类基因修饰模型构建中的进展进行综述和展望。     

Xist敲降可以改善孤雄单倍体囊胚质量

单倍体胚胎干细胞研究一直以来吸引着研究者们的注意,它可以用作基因修饰的工具或是用于药物筛选。随着孤雄胚胎干细胞系的成功建立,更扩展了单倍体胚胎干细胞的应用前景。但单倍体孤雄胚胎发育率低,胚胎质量差,制约着孤雄单倍体胚胎干细胞的建系。为改善孤雄单倍体胚胎发育潜能及胚胎干细胞建系效率低的问题,我们检测了小鼠(Mus musculus domesticus)孤雄单倍体胚胎的体外发育过程和该过程中Xist基因表达情况。结果发现,孤雄单倍体胚胎囊胚发育率只有10%~14%,发育至囊胚所需时间差异较大,从3.5~5.5 d不等。通过核糖核酸荧光原位杂交实验(RNA-FISH)跟踪Xist基因表达情况,发现其在发育至囊胚阶段的胚胎中呈抑制状态,而在早期胚胎中多呈表达状态。通过si RNA扰低Xist表达,虽然没有改变孤雄单倍体胚胎发育到囊胚的比例,但显著提高了囊胚质量,并提高了接种胚胎内细胞团(ICM)后建立细胞系的效率。结果说明,Xist基因的表达可能是导致小鼠孤雄单倍体胚胎质量差、干细胞建系率低的原因之一。     

四类不同倍性鲫鱼在胚胎发育期间同工酶基因表达的比较分析

用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳比较分析了单倍体、二倍体、三倍体和复合四倍体4类不同倍性鲫鱼以及单倍体和二倍体鲤鱼在胚胎发育时期4种同工酶(EST,LDH,MDH,SOD)酶谱。结果表明,单倍体鲫鱼和单倍体鲤鱼胚胎与各自的二倍体胚胎相比,同工酶酶谱看不出差异;天然三倍体银鲫胚胎的MDH和SOD同工酶酶谱与二倍体鲫相似,但EST和LDH同工酶比二倍体增多了酶带,有的酶带如EST5和EST6还可在鲤鱼胚胎中找到相应的表达产物,提供了天然雌核发育三倍体银鲫杂交起源的证据;复合四倍体由于含有鲤鱼的一个外来基因组,其胚胎的基因表达有些与杂种类似,在所分析的4种同工酶酶谱中,都可观察到来自鲤鱼基因的影响。此外,在由源于不同复合四倍体个体的卵子发育形成的胚胎间,还观察到同工酶基因表达的异质性。     

可长期培养的“人造精子”——记小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞的建立

对于具有两倍体基因组的高等生物来说,想要进行某个基因功能的研究并非易事,需要对两个等位基因同时进行相同的操作。因此,如何在这些生物中,能像单倍体酵母那样易于开展基因筛选和改造工作,是众多科学家关心的问题。最近,Anton Wutz和JosefM.Penniger两个实验室相继获得小鼠单倍体胚胎干细胞,并证明其能很好的应用于正反向遗传筛选。但是,这些细胞是否能够将基因研究工作从细胞水平上升至动物水平,依然未知。基于此,李劲松和徐国良两个实验室通力合作,获得了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞AG-haESC,并称其为"人造精子"。因为这种"人造精子"不仅维持了较好的雄性印迹,能够如同精子一样注入卵母细胞后将遗传性状传递给后代;并且在体外能够长期培养扩增,可应用于基因的改造工作。孤雄单倍体胚胎干细胞的成功建立,为今后更有效、更快捷地获得基因改造动物提供了新的思路。     

金鱼etv2基因的克隆及在雌核发育单倍体和自交二倍体胚胎中的差异表达

为研究鱼类雌核发育单倍体循环系统发育异常的原因, 从金鱼(Carassius auratus)中克隆了血管发生主调控基因etv2(Ets variant 2)的全长cDNA序列, 并比较分析了该基因在雌核发育单倍体和自交二倍体中的表达。金鱼etv2 cDNA全长1531 bp, 其开放阅读框为1116 bp, 编码371个氨基酸。序列对比分析表明, 金鱼ETV2蛋白的C端含有ETS(E26 transformation-specific)转录因子家族所共有的ETS DNA结合结构域, 该结构域氨基酸序列与其他脊椎动物ETV2的同源性超过60%。RT-PCR和荧光实时定量PCR分析结果表明, etv2在自交二倍体金鱼成体的肝脏、心脏、肌肉、肾脏、精巢、脑和脾脏等多种器官组织中表达, 但在卵巢和成熟卵子中不表达; 在金鱼胚胎发育过程中, etv2从尾芽期开始表达, 在体节形成后, etv2表达水平随胚胎发育而升高, 在20体节期达到峰值, 随后其表达水平降低。整胚原位杂交显示etv2特异性表达于自交二倍体金鱼胚胎的侧板中胚层、成血管细胞以及血管内皮细胞。在14体节期和20体节期, 雌核发育单倍体胚胎中etv2在躯干及尾部的部分区域表达减弱或缺失, 特别是在胚胎中线表达消失, 并且其整体表达水平显著低于自交二倍体。上述结果说明在金鱼雌核发育单倍体胚胎中成血管细胞数量减少并存在向中线迁移的障碍, 可能是导致雌核发育单倍体血管发生异常的重要原因。     

小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞增殖的研究

孤雄单倍体胚胎干细胞(androgenetic haploid embryonic stem cells,AG-ha ESCs)是来源于只具有一套精子染色体组的单倍体胚胎。小鼠AG-ha ESCs在培养中呈现克隆较小、生长缓慢的现象。该研究比较了小鼠AG-ha ESCs与正常二倍体胚胎干细胞(R1细胞)、二倍化后的AGha ESCs(DAG-ha ESCs)的生物学特征并探索其中的机制。结果表明,尽管小鼠AG-ha ESCs与R1细胞一样成集落样生长、边缘光滑清晰,但细胞大小与增殖速率均显著小于R1细胞;DAG-ha ESCs的增殖速率略高于AG-ha ESCs,但仍然显著低于R1。更为重要的是,通过RT-q PCR检测分析表明,AGha ESCs和DAG-ha ESCs细胞周期调控网络有异常,因此,单倍体基因组转录调控的异常是小鼠AGha ESCs增殖缓慢的关键因素,而不是克隆大小和二倍化。该研究为今后AG-ha ESCs细胞周期调控方面的进一步研究提供了良好的平台。     

“人造精子”与CRISPR-Cas

小鼠单倍体胚胎干细胞系的建立为遗传学的正反向筛选提供了一种简便而又有效的工具。除此之外,孤雄单倍体胚胎干细胞能替代精子使卵母细胞"受精"这一特性,更是实现了从细胞水平向动物水平的完美转变。无论是从制备多基因遗传操作动物模型的角度,还是在小鼠个体水平遗传筛选的层面,孤雄单倍体胚胎干细胞的出现都将为基因功能学研究带来新的生命力。然而,孤雄单倍体的"受精"能力极其有限,其产生健康半克隆小鼠的效率仅约2%,这也成为孤雄单倍体在个体水平广泛应用所面临并且亟需突破的一大瓶颈。通过正反面的实验验证,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所李劲松课题组发现,雄性印记区域H19-DMR和IG-DMR的异常去甲基化是半克隆小鼠发育异常的"祸根"。通过敲除这两个DMR,成功将半克隆小鼠的出生效率提高至20%,为利用孤雄单倍体获得多基因遗传操作动物模型提供了最根本有力的保障。最后,结合CRISPR-Cas9技术,他们创建了孤雄单倍体的sg RNA文库,并成功将此"细胞文库"转化成携带基因突变的"小鼠文库",由此创建了"个体水平"遗传筛选的新方法、新思路。     

染色体组分割的甘蓝型油菜单倍体的形成途径

在３６０株甘蓝型油菜与诸葛菜的属间远缘杂种自交后代中,发现了３株单倍体植株。通过对杂种的细胞学表明,染色体组分割和核融合是单倍体的形成机制。通过人工加倍,获得了纯合二倍体植株。对纯合二倍体研究表明：纯合二倍体具有高度遗传稳定性,具有与花粉植株的纯合二倍体的同样的育种意义。     

雌核发育兰州鲇胚胎发育和形态特征的研究

该研究通过紫外线(UV)灭活的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)精子利用冷休克方法诱导兰州鲇(Silurus lanzhouensis)雌核发育二倍体(G_(2n))、单倍体(N)、杂交二倍体(H_(2n)),以及同源精子诱导的普通二倍体(2N)的胚胎发育时序和发育生物学特征进行了观察比较。结果显示,(1)受精率为2NH_(2n)NG_(2n),孵化率为2NG_(2n)N,畸形率为NG_(2n)2N。(2)在水温23 °C下,普通二倍体48 h孵化出膜,雌核发育二倍体51 h孵化出膜,杂交二倍体在神经胚期(26 h 20 min)停止发育,单倍体在出膜前期(43 h)停止发育。(3)各组胚胎发育形态上的差别主要表现在杂交二倍体未形成正常胚体,单倍体表现出典型的单倍体综合征,雌核发育二倍体初孵仔鱼在形态学上与普通二倍体无明显差异。该研究为兰州鲇雌核发育技术提供了技术支撑,同时也为单倍体、杂交和雌核发育胚胎的细胞生物学研究提供了理论依据。     

卵子介导细胞重编程的基础与应用研究

细胞重编程一般是指将分化细胞转变成全能性胚胎或多能性细胞的过程,是研究发育和分化的重要手段,为再生医学、疾病个体化治疗及药物筛选等提供了巨大的应用前景。诱导细胞重编程的方法有多种,如细胞培养、卵子介导的核移植(nuclear transfer)、细胞融合、山中伸弥因子介导的诱导多能干细胞(i PSC)技术等。以国家自然科学基金重大研究计划为依托,李劲松课题组围绕着卵子介导的细胞重编程领域开展了系统的研究,取得了一系列突破性的进展:完善了卵子介导的核移植体系;建立精子和卵子来源的"类精子"的单倍体胚胎干细胞系和半克隆技术;建立人和猴子的孤雌单倍体胚胎干细胞系;卵子介导的重编程与i PSC技术比较揭示影响重编程的重要因子;建立卵子介导遗传疾病治疗的策略。现主要对卵子介导细胞重编程的基础与应用研究的原创性实验成果进行综述,并展望未来关注的重点研究方向。     

干细胞与再生医学研究进展

干细胞具有分化成为体内所有类型细胞的能力,因此,其在再生医学治疗、体外疾病模拟、药物筛选等方面具有广阔的应用前景。干细胞技术在近些年取得了突飞猛进的发展,特别是诱导多能性干细胞的出现使干细胞领域经历了一场巨大的变革。我国干细胞研究在这场干细胞技术变革中取得了多项重大成果,逐渐成为了世界干细胞研究领域中的重要力量。本综述着重介绍近几年来,主要是诱导多能性干细胞技术出现之后,我国在干细胞和再生医学领域取得的重要进展,主要涵盖诱导多能性干细胞、转分化、单倍体干细胞以及基因修饰动物模型和基因治疗等方面。     

诱导多能干细胞及其在神经退行性疾病研究中的应用

用干细胞转录因子OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4进行体细胞重编程产生具有胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞(iPS细胞)是干细胞研究领域的突破性进展。近年来,iPS细胞的研究从产生方法、重编程机理及实际应用方面不断取得进展。由于iPS细胞的产生可取自体细胞,因而克服了胚胎干细胞应用的伦理学和免疫排斥等缺陷,为iPS细胞的临床应用开辟了广阔的前景。该文将对iPS细胞的产生方法、重编程机理及其在神经性退行性疾病的研究与应用进行文献综述,反映近几年iPS细胞最新研究成果,并阐述了用病人iPS细胞模型探讨帕金森氏病、老年性痴呆症、脊髓侧索硬化症、脊髓肌肉萎缩症及舞蹈症等5种常见神经性退行性疾病发病机理的研究现状。     

人工诱导泥鳅雌核发育的细胞学研究和诱导参数优化

为培育泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)全雌品种,研究通过细胞荧光染色后进行细胞学观察确定人工诱导泥鳅雌核发育的热休克起始时间,并进一步利用核型和流式细胞分析等方法对人工诱导雌核发育泥鳅进行鉴定。结果显示,二倍体泥鳅受到灭活的鲤(Cyprinus carpio)精子刺激后,第二极体与卵核分开的时间在人工授精后3—5min;卵子在人工授精后3.5min后再热休克2min的诱导孵化率达到10.26%。通过分析野生型泥鳅胚胎、人工诱导雌核发育泥鳅胚胎、泥鳅×鲤杂交胚胎和单倍体泥鳅胚胎的发育,发现部分雌核发育的胚胎可以正常发育,而杂交胚胎和单倍体胚胎会出现明显的发育障碍。核型和流式细胞检测分析表明利用本研究获得的热休克参数进行处理可得到二倍体雌核发育子代,二倍率达64.71%。研究从细胞学层面获得泥鳅雌核发育的诱导参数,可为利用人工诱导雌核发育开展全雌泥鳅育种提供指导。     

近交对单倍体-二倍体种群平衡遗传多态性的影响

本文通过对一个双等位基因位点在产雄孤雌生殖遗传体系下不完全同胞交配的模拟 ,研究了在显性、共显性和超显性遗传模式下近交对平衡多态性的影响。结果显示 :相对于二倍体 -二倍体种群 ,不完全同胞交配会减少产雄孤雌生殖种群的遗传变异。然而 ,在各种情况下 ,近交对单倍体 -二倍体种群的总体影响不如对二倍体 -二倍体种群极端     

“人造精子”介导基因编辑技术的建立与应用

"人造精子",即小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞,是一种可在体外长期培养扩增和进行遗传操作的细胞,因其具备胚胎干细胞自我更新和多向分化的特性,并拥有代替精子使卵母细胞"受精",产生半克隆小鼠的能力,而被广泛应用于生命科学研究的各个领域。与CRISPR-Cas9技术相结合,"人造精子"能够同时实现细胞水平和动物水平的复杂基因编辑,因此可作为一个有力的研究工具。本文就"人造精子"技术的建立与改进、在基因编辑方面的应用,以及全基因组标签计划的提出与进展展开综述。     

人胚胎干细胞向内皮祖细胞诱导分化及其应用研究进展

近年来,内皮细胞的应用价值不断提高,应用领域不断拓宽,但其来源有限,成为研究应用的主要障碍.胚胎干细胞在体外可分化为多种组织细胞系,有可能成为获取内皮细胞的另一来源.就人胚胎干细胞向内皮祖细胞分化、分离方法、相关分子机制及内皮祖细胞应用价值等进行阐述,以期能够引起更多的关注,推动其研究的进展.     

microRNA在胚胎干细胞中的表达及作用

摘要: 胚胎干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞, 其自我更新和多向分化过程都在遗传和表观遗传的严格调控下进行的。越来越多的研究表明microRNA 也在这一过程中发挥重要的作用。microRNA是一类内源性的非编码RNA, 能够通过与靶mRNA特异性的结合而导致靶mRNA降解或抑制其翻译, 从而对基因进行转录后调控。文章就microRNA在胚胎干细胞中的表达及其作用的研究进展做一综述。主要讨论一些在胚胎干细胞中特异性表达的microRNA, 以及这些microRNA 对胚胎干细胞自我更新和未分化状态的维持和继续分化增殖的调控作用。