Aurora 激酶A调节小鼠受精卵早期发育

Aurora激酶是参与细胞周期调节的重要激酶,已成为肿瘤研究领域的热点．近年来有研究表明, Aurora激酶A(Aurora kinase A,AURKA)对卵母细胞减数分裂也起到重要的调节作用,但对其在哺乳动物早期胚胎发育中的研究鲜有报道．本研究利用显微注射向受精卵中导入干扰AURKA表达的质粒,观察了AURKA表达敲低对小鼠受精卵早期发育的影响,并检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）通路抑制后,小鼠受精卵卵裂及AURKA表达与活性变化．实验结果表明,干扰AURKA的表达可导致受精卵发育停滞和异常分裂．MAPK通路的抑制亦可破坏受精卵正常卵裂,并下调AURKA的蛋白表达及活性．实验结果提示,AURKA是小鼠受精卵早期发育所必需的,并与MAPK通路的激活相关．     

Wee1B蛋白S15位点突变抑制小鼠1-细胞期受精卵的发育

为研究小鼠Wee1B蛋白S15位点磷酸化状态对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,构建pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-S15A（Ser突变成Ala）/D（Ser突变成Asp）突变体,体外转录成mRNAs. 对小鼠进行超排卵后当晚与雄鼠1∶1合笼,第2 d早取受精卵后培养至S期,显微注射Wee1B-WT(野生型)/KD（激酶失活型)-mRNAs和突变体Wee1B-S15A/D-mRNAs,观察其对受精卵发育、有丝分裂促进因子（MPF）活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响.结果表明,过表达Wee1B -WT和Wee1B-S15A/D可有效抑制受精卵有丝分裂进程,明显降低卵裂率. 过表达模拟磷酸化的突变明显抑制MPF的活性,CDC2-pTyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致. 因此,在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠Wee1B蛋白S15位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式.     

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的生物学功能研究

Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP）属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP）家族,广泛存在于各种生物中,参与了对细胞内多种信号转导通路的调节作用。RKIP可以与Raf-1结合,从而抑制MAPK信号转导通路,并参与了对G蛋白偶联受体信号通路和NF-κB信号通路的调控。RKIP在膜的生物合成、精子发生、神经发育和细胞凋亡等生理过程中发挥重要作用,并参与了老年痴呆症及糖尿病等的病理过程。此外,近年来的研究表明RKIP是一个新的转移抑制因子,可以抑制前列腺癌、人乳腺癌和黑色素瘤细胞的转移,并已成为一个新的前列腺癌诊断标志物。     

G蛋白偶联受体激酶的调控

G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase,GRK)特异地使活化的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)发生磷酸化及脱敏化,从而终止后者介导的信号转导通路。研究表明,GRK的功能被高度调控,并具有下行调节GPCR的能力。调控GRK功能的机制包括两个层次：(1)多种途径调控激酶的亚细胞定位及活性,包括GPCR介导、G蛋白偶联、磷脂作用、Ca^2 结合蛋白调控、蛋白激酶C活化、MAPK反馈抑制、小窝蛋白抑制等;(2)调控GRK表达水平,主要体现在其与某些疾病的联系。     

dbcAMP通过Cdc25B蛋白调控小鼠1-细胞期受精卵发育

为了研究PKA激活剂dbcAMP通过调控小鼠Cdc25B蛋白S149和S321位点磷酸化状态影响 小鼠1-细胞期受精卵的发育,将质粒pBSK-Cdc25B-WT、pBSK-Cdc25B-S149A、pBSK- Cdc25B-S321A和pBSK-Cdc25B-S149A/S321A体外转录成mRNA;显微注射入S期受精卵中 ,在2 mmol/L dbcAMP的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、MPF活性及CDC2- pTyr15磷酸化状态的影响. 结果显示,在有dbcAMP存在时,各组受精卵卵裂时间延迟 ,但Cdc25B-S/A mRNAs注射组受精卵卵裂率明显高于Cdc25B-WT mRNA注射组,MPF 活性提前达到高峰;CDC2-pTyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致. 因此,在小鼠1- 细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠Cdc25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化 修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式.     

雷帕霉素靶在小鼠受精卵早期发育中的作用研究

哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)是细胞生长的中心调控因子,应用RT-PCR、免疫印迹、放射性同位素体外测定酶活性等方法,研究mTOR在小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中在卵中的表达、活性变化以及对卵裂的影响.研究发现mTOR在小鼠卵母细胞和受精卵中都有表达,在mRNA水平,mTOR从G2期开始降解,在蛋白水平,则各期没有明显变化;mTOR的激酶活性在受精后明显升高,并且在整个1-细胞期保持较高活性;mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素能抑制卵裂,并且能抑制成熟促进因子MPF的调节亚基cyclin B的表达,从而抑制了MPF的活性.结果表明mTOR可能通过促进MPF的激活而促进小鼠受精卵的分裂.     

胰岛素在小鼠受精卵早期发育中的作用

大量研究已经证实生长因子和激素在胚胎早期发育的细胞增殖与分化过程中起着重要的作用．应用定量ELISA,RT—PCR,免疫印迹和免疫荧光的方法检测胰岛素在小鼠受精卵和卵母细胞中的表达和定位．发现胰岛素均匀分布在卵细胞的胞浆中．同时也检测到mTOR（mammalian target of rapamycin）和p70S6K的表达、活性和定位．在小鼠受精卵中mTOR和p70S6K的表达没有明显不同．二者在G1,G2和M期分布在细胞浆,在S期聚集在原核的周围．在不同时期,mTOR的活性是波动的．利用P13K的特异性抑制剂渥曼青霉素,观察到卵裂率明显减低．当使用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素时,受精卵的第一次有丝分裂延迟．这些结果表明胰岛素存在于小鼠的卵母细胞和受精卵中,并且胰岛素可能通过激活P13K／PKB／mTOR／S6K的信号传导通路在小鼠的早期胚胎发育中发挥功能作用．     

小鼠受精卵早期发育过程中PKC对cdc2和cdc25C活性的影响

为研究小鼠受精卵细胞早期发育过程中PKC对cdc2和cdc2 5C活性的影响 ,采用免疫印迹和电泳迁移率差异分析的方法 ,观察PKC的激活剂TPA及其抑制剂星形孢子素对小鼠受精卵一细胞期cdc2和cdc2 5C活性的影响 .10nmol L的TPA作用 10min后 ,小鼠受精卵一细胞期卵裂率明显大于对照组 (P <0 0 5 ) ,而星形孢子素作用后卵裂率显著下降 (P <0 0 1) .TPA处理后 ,受精卵中呈去磷酸化状态的活性cdc2明显增加 ,没有活性呈磷酸化状态的cdc2 5C明显减少 ;而星形孢子素处理的受精卵中没有活性的cdc2明显增加 ,有活性的cdc2 5C明显减少 .结果表明 ,TPA短时间作用可以促进小鼠一细胞期受精卵分裂 ,星形孢子素抑制受精卵的分裂 ;TPA可以促进cdc2的去磷酸化以及cdc2 5C的磷酸化 ,从而促进G2 M转换 ,星形孢子素则抑制cdc2和cdc2 5C的活性 ,阻止受精卵由G2 期进入M期     

小鼠受精卵微注射Cdc25b mRNA可提高卵裂率并促进受精卵发育

为了观察Cdc25B蛋白及PKA/Cdc25B 信号途径在小鼠受精卵发育中的作用,将突变型和野生型Cdc25b转录成 mRNA,显微注射到小鼠受精卵中,放入含有或不含有dbcAMP的M16中,相差显微镜下观察受精卵卵裂情况;用蛋白激酶活性测定方法检测MPF的活性;利用Western 印迹检测Cdc2-Tyr15的磷酸化状态.结果显示,未加dbcAMP的Cdc25b- S321A mRNA注射组与Cdc25b-WT组相比,能够提前使受精卵发生G ₂/M期转变,导致卵裂,并明显提高卵裂率;MPF的活性测定和Cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测结果也显示,Cdc25b-S321A组先于Cdc25b-WT组提前激活MPF.此外, Cdc25b-S321A mRNA注射组可以有效恢复由PKA引起的受精卵G ₂期阻滞,显著增加卵裂率;MPF的活性测定和Cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测结果也显示,在PKA持续激活的情况下,对比于Cdc25b-WT组,Cdc25b-S321A组提前激活MPF.因此,在小鼠受精卵发育过程中PKA主要通过磷酸化Cdc25B的321位丝氨酸,从而调控MPF的激活与失活来控制有丝分裂进程.     

蛋白激酶C_ζ对小鼠受精卵发育早期基因组转录活化的影响

为研究蛋白激酶Cζ (proteinkinaseCζ ,PKCζ)在小鼠受精卵细胞早期发育过程中对胚胎基因组活化影响 ,采用免疫印迹和细胞免疫荧光的方法 ,观察PKCζ的抑制剂对小鼠受精卵 1 细胞期G1和G2 不同时期小鼠受精卵基因组活化的影响 .小鼠 1 细胞期受精卵蛋白激酶C (PKC)的活性不断增加 ,并在G2 期达到最高 .PKC的抑制剂calphostinC可以明显抑制PKC的活性达 4 7% .同时calphostinC对受精卵 1 细胞期基因组的早期活化具有显著的抑制作用 (P <0 0 1) .在小鼠 1 细胞期受精卵的G2 期 ,具有活性的磷酸化PKCζ的含量明显多于G1期和卵母细胞MⅡ期 ,分别比它们高2 7%和 110 % .PKCζ的特异性抑制剂可以抑制受精卵 1 细胞期基因的转录和活化 (P <0 0 5 ) .实验结果表明 ,PKCζ参与了小鼠受精卵基因组早期转录的调控     

转化生长因子β激活性激酶在胶质细胞信号转导中的作用机制

丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和 NFκB介导了炎症细胞转录活性的信号转导过程.转化生长因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1,TAK1）是这些转导通路的上游激酶.通过在胶质细胞株中瞬时转染TAK1和它的结合蛋白因子（TAK1-binding protein1 TAB1）基因,或与iNOS(可诱导型氧化氮合酶基因)启动子报告基因（iNOS-Luc）质粒共转染,探讨中枢两类胶质细胞在炎症反应过程中TAK1诱导iNOS 和细胞因子表达的作用机制.结果显示,TAK1明显激活iNOS 和细胞因子（TNFα、IL-1、IL-6）的表达活性. 而且当使用它的下游激酶p38 MAPK、JNK和NFκB的抑制剂（SB203580、SP620125和CAPE）后,这些表达活性明显被抑制.用IκBα的磷酸化突变体质粒(IκBαM)共转染胶质细胞株,能完全抑制iNOS的表达活性.研究结果提示：在胶质细胞内的p38 MAPK、JNK和NFκB信号介导的iNOS和细胞因子的转录表达过程中,TAK1起着非常重要的调节作用.     

蛋白激酶Cα在小鼠孤雌及四倍体胚胎早期发育过程中的分布和作用

为了观察蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα在昆明白小鼠受精卵、孤雌激活和四倍体胚胎早期发育阶段的亚细胞定位和致密化进程中的表达变化,本实验利用免疫荧光化学染色与激光共聚焦显微镜观察相结合的方法,对受精卵、孤雌激活和四倍体胚胎早期发育阶段PKCα的表达进行了定位观察,并利用Western blot对三组胚胎致密化进程中PKCα的表达进行定量分析.结果显示,PKCα在上述三组胚胎发育的2-细胞期至囊胚期均有表达,虽然不同胚胎PKCα的分布在同一发育阶段存在差异,却表现出在各胚胎期主要分布于卵裂球核染色质内,以及在胚胎致密化开始,PKCα在卵裂球连接处发生重新分布的共同特点.此外,三组胚胎PKCα在致密化进程中的表达呈升高趋势,即致密化后的表达高于敛密化前.结果表明,PKCct对胚胎致密化的调节具有重要作用,其在8-细胞/4-细胞期的重新分布是胚胎进入桑椹胚期的必然事件,是胚胎致密化的前提,同时伴随蛋白表达增多.此外,PKCα在囊胚期发生了植入前的第二次重新分布.PKCα在三组胚胎各发育阶段表达情况各不相同,它对小鼠胚胎发育的影响体现在整个早期发育阶段.PKCα在小鼠受精卵早期发育阶段的两次重新分布可能与在致密化开始时启动的细胞黏附事件存在某种必然联系.     

Aurora蛋白激酶及其抑制剂的研究进展

Aurora激酶是一类在细胞周期调控中具有重要作用的丝/苏氨酸蛋白激酶,包括三个成员:Aurora A、B、C.Aurora激酶在大多数肿瘤中均高表达,其异常调控与肿瘤的发生发展密切相关.近年来,Aurora激酶抑制剂作为抗肿瘤候选药物受到广泛的关注,已有一些进入临床试验,且表现出良好的抗肿瘤活性.本文围绕Aurora家族的三个成员,讨论了其在细胞有丝分裂过程中的生物学功能、与肿瘤发生发展的关系及其抑制荆的研究进展,指出其作为抗肿瘤药物靶点的潜在价值.     

支架蛋白GIT2通过与Smad3相互作用调节其转录活性

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinase interacting proteins 2,GIT2)是一种信号支架蛋白,可募集多种信号通路的关键分子,参与肌动蛋白细胞骨架组装、整合素介导的细胞粘附、G蛋白偶联受体的内化及胞内信号传递等生物学过程. 采用酵母双杂交实验证明,TGF-β1信号通路的转录因子Smad3是GIT2的相互作用蛋白质,内、外源免疫共沉淀实验均证实,GIT2与Smad3存在蛋白质相互作用. 报告基因实验及免疫印迹结果表明,GIT2增加Smad3的转录活性并增强TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化.研究还发现,Git2-/-小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的Smad3磷酸化受到抑制,其骨形成相关靶基因的表达水平也低于Git2+/+小鼠. 本研究表明,GIT2通过与Smad3的相互作用调节其转录活性并活化TGF-β1信号通路,可能参与调节骨髓间充质干细胞的分化.     

WEE1 激酶及其抑制剂在抗肿瘤治疗中的应用进展

WEE1激酶是一种细胞周期调节蛋白,能调控细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)的磷酸化状态,从而调节CDK1与细胞周期蛋白B(cyclin B)复合物的活性从而实现对细胞周期的调控,且对DNA损伤检查点具有重要的调节作用。WEE1是G2/M期阻滞的关键基因,起着重要的监测作用,在一些癌症中过表达,抑制或下调WEE1激酶均能引发有丝分裂灾难,因此WEE1激酶抑制剂可能在抗癌治疗中有关键作用。在癌症的治疗过程中,WEE1抑制剂与DNA损伤剂、化学药物等联合使用会得到比单独使用更为有效,且在p53缺失的癌细胞中能发挥更好的效果。目前WEE1已成为许多癌症治疗的关键靶点之一,其抑制剂MK-1775已处于临床研究阶段,且能增强一些DNA损伤剂对p53缺失的癌细胞的杀伤能力。本文就WEE1激酶及其抑制剂在抗癌治疗中的应用作一综述。     

磷脂酰乙醇胺结合蛋白的基础和临床研究

磷脂酰乙醇胺结合蛋白 ( phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP )是一类高度保守的多功能蛋白质,广泛存在于不同物种中.在同一物种的多种组织和不同类型细胞中均有表达.PEBP在多条信号转导通路中具有重要的调控作用.PEBP通过与Raf-1相互作用抑制MAPK信号通路的活性,因此也被称为Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP);同时,PEBP还参与了PKC、G蛋白偶联受体和NF-κB信号通路的调控.在临床医学研究中发现,PEBP作为海马胆碱神经刺激肽(HCNP)的前体蛋白在阿尔采末病(AD)的形成过程中发挥重要作用.由于PEBP可以抑制肿瘤转移和促进肿瘤细胞凋亡,因此也被认为是一种肿瘤转移的抑制基因.新近研究表明,PEBP参与细胞周期的纺锤体检查点的调控,PEBP的缺失可导致染色体异常.在直肠结肠癌,PEBP基因启动子区的高甲基化可导致其不表达,这可能是癌症转移的分子基础.     

粘附斑激酶(FAK)及其信号通路研究进展

粘附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一类胞质非受体蛋白酪氨酸激酶,属于蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase)超家族,因而也称为PTKⅡ.FAK在细胞信号转导中处于十分重要的位置,它是胞内外信号出入的中枢,介导多条信号通路.FAK可以整合来自整合素、生长因子以及机械刺激等的信号,激活胞内PI3K/Akt、Ras/MAPK等信号通路,调节细胞生长.FAK还与胚胎发育、肿瘤发生与迁移有关.     

阳性表达表皮钙粘蛋白增加G0/G1期人乳腺癌细胞比例及其分子机制

表皮钙粘蛋白（E-cadherin）阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435转染野生型表皮钙粘蛋白基因,通过流式细胞仪测量细胞周期发现表皮钙粘蛋白阳性细胞生长变慢,更多细胞停滞在G0/G1期,蛋白质印迹证实由G0/G1期进入S期的重要调控分子细胞周期蛋白-D1（cyclin D1）下降了,并发现表皮钙粘蛋白还能降低直接激活细胞周期蛋白-D1基因转录的β-连环蛋白的蛋白质浓度.蛋白激酶B（PKB）能通过抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的活性来抑制β-连环蛋白降解,并在乳腺癌高转移细胞株中普遍过表达,其表达同样受到了表皮钙粘蛋白的抑制.并且在表皮钙粘蛋白阳性细胞中,作为PKB上游信号分子并能激活PKB的粘着斑激酶 (FAK) 和整联蛋白相关激酶(ILK)蛋白量也发生下降,能抑制PKB激活的PTEN蛋白量却增加了.结果显示,表皮钙粘蛋白能通过降低乳腺癌细胞中的PKB蛋白浓度,并通过上游信号分子抑制PKB的激活,进而降低PKB对β-连环蛋白降解的抑制作用,导致β-连环蛋白直接调控的靶基因细胞周期蛋白D1的表达量下降,引起更多的细胞停止在G0/G1期.     

Cdc25B在小鼠受精卵的表达和定位

为阐明细胞分裂周期(Cdc)25B调控小鼠受精卵发育的机制,利用Western印迹检测小鼠受精卵各时期Cdc25B的表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。利用间接免疫荧光技术观察Cdc25B在小鼠受精卵的定位。构建pEGFP-Cdc25B融合表达载体并显微注射到受精卵中,观察Cdc25B在受精卵M期的定位变化。结果表明Cdc25B在G1和S期被磷酸化,在G2和M期去磷酸化。Cdc2-Tyr15在G1和S期处于磷酸化状态,G2期只检测到Cdc2-Tyr15轻微的磷酸化信号,M期未检测到任何Cdc2-Tyr15的磷酸化信号。Cdc25B在G1期定位于细胞质和细胞核中,S和G2期定位于细胞质的皮质部分,M期由细胞质转向核区。证明Cdc25B核输出后激活有丝分裂促进因子,从而启动小鼠受精卵的有丝分裂。     

草菇丝裂原活化蛋白质激酶编码基因VV-MAPK的克隆和序列分析

<正>丝裂原活化蛋白质激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是丝/苏氨酸蛋白质激酶的一个大家族,广泛存在于真核生物中(Widmann et al.1999)。真核生物的MAPK通路由三级激酶组成,