家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

家蝇泛素编码区 cDNA 序列的克隆及在原核细胞中的表达

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用。本研究根据 GenBank 已登录的真核生物泛素（ubiquitin）编码框的氨基酸序列,设计一对简并引物,RT-PCR 克隆了家蝇 Musca domestica 泛素基因的编码区 cDNA 序列,并进行了测序。序列分析表明,该编码区的长度为 228 bp,编码 76 个氨基酸,命名为 Mdubi ,GenBank 登录号为 DQ115796。同源性比较发现,Mdubi 氨基酸序列与其他真核生物泛素编码框同源性可达 94% 以上。RT-PCR 检测表明,Mdubi 在家蝇不同组织中均高效表达,且不受大肠杆菌 Escherichia coli 刺激的影响,是遍在性表达。为进一步研究 Mdubi 的结构和功能,将 Mdubi 克隆到原核表达载体 pQE30 上,构建重组质粒 pQE30-UBI,转化大肠杆菌 M15 感受态细胞,在 IPTG 诱导下进行了高效表达,SDS-PAGE 检测表明 Mdubi 在大肠杆菌中可表达相对分子质量为 9.6 kD 的可溶性融合蛋白;Western blot 分析表明表达产物能与 Ni-NTA 鏊合物特异性的结合,表明表达的 Mdubi 为 N 端带有 6His 标签的融合蛋白。利用 Ni²⁺-NTA 亲和柱一步纯化了 Mdubi,以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗 Mdubi 血清。本研究成功克隆了家蝇泛素的编码序列,并在原核细胞中得到了表达,为进一步研究泛素在家蝇体内的作用机制奠定了基础。     

家蝇细胞凋亡起始酶Caspase-1基因的克隆及在不同虫态的表达

为了研究Caspases家族在昆虫发育变态中的作用,通过RT-PCR扩增并结合RACE技术,克隆得到家蝇Musca domestica Caspase-1基因1条,命名为Mdom-Caspase-1（GenBank中cDNA序列号为EU854472, 氨基酸序列号为ACF71490）。该基因全长1 295 bp,阅读框序列870 bp,共编码289个氨基酸,理论分子量32.83 kDa,等电点8.67。 Mdom-Caspase-1蛋白有5个保守的半胱氨酸位点QACQG, 具有Caspase的典型特征; 整个分子呈现亲水性, 有8个区域共89个氨基酸为亲酯性, 蛋白质二级结构主要由11个α螺旋区、7个β-折叠区、17个β-转角区组成。昆虫间Caspase-1分子具有明显的保守性, Mdom-Caspase-1与黑腹果蝇Drosophila melanogaster、埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦库蚊Culex quinquefasciatus的Caspase-1氨基酸序列相似性为65%~77%。RT-PCR半定量分析结果表明, Mdom-Caspase-1基因在家蝇各个虫态中均有表达, 但在卵期、3龄幼虫、预蛹、蛹和羽化5 d的雌虫中的表达量明显高于其他虫态。这些结果提示Caspase-1可能与昆虫发育变态关系密切, 为进一步研究昆虫Caspase-1功能、设计Caspase-1抑制剂提供了分子基础。     

家蝇MdSOD3基因的鉴定及其在抵抗重金属胁迫中的作用

超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶, 在昆虫抗氧化保护过程中起着重要作用。本研究通过RT-PCR技术鉴定了家蝇Musca domestica MdSOD3基因(GenBank登录号为JQ408979), cDNA序列817 bp, 开放阅读框534 bp, 推导的多肽序列含有177个氨基酸。同源性分析及NJ法系统分析表明MdSOD3与其他物种的Cu/ZnSOD关系较近。荧光定量PCR检测该基因在家蝇幼虫脂肪体、 肠、 表皮和血细胞中不存在差异表达; 在受到不同浓度重金属Cd²⁺刺激时, MdSOD3基因呈诱导性表达, 5 mmol/L 时表达量最高。通过RNAi策略技术成功敲低MdSOD3表达水平。将RNA干扰60 h的幼虫置于5 mmol/L Cd²⁺处理24 h后死亡率明显升高, 并且出现中毒表象。NBT活性染色检测到体外重组表达的MdSOD3具有明显的酶活性。结果提示MdSOD3基因可能在家蝇抗逆防御过程中起着重要作用。     

Identification of the gene MdSOD3 and its role in resisting heavy metal stress in housefly (Musca domestica)

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,在昆虫抗氧化保护过程中起着重要作用.本研究通过RTPCR技术鉴定了家蝇Musca domestica MdSOD3基因(GenBank登录号为JQ408979),cDNA序列817 bp,开放阅读框534 bp,推导的多肽序列含有177个氨基酸.同源性分析及NJ法系统分析表明MdSOD3与其他物种的Cu/ZnSOD关系较近.荧光定量PCR检测该基因在家蝇幼虫脂肪体、肠、表皮和血细胞中不存在差异表达;在受到不同浓度重金属Cd2+刺激时,MdSOD3基因呈诱导性表达,5 mmol/L时表达量最高.通过RNAi策略技术成功敲低MdSOD3表达水平.将RNA干扰60h的幼虫置于5 mmol/L Cd2+处理24h后死亡率明显升高,并且出现中毒表象.NBT活性染色检测到体外重组表达的MdSOD3具有明显的酶活性.结果提示MdSOD3基因可能在家蝇抗逆防御过程中起着重要作用.     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因BmGSTz1的克隆、序列分析及组织表达特征

谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是一个功能广泛的超基因家族, 其中Zeta家族在动物、植物和细菌中均有分布。在哺乳动物中, Zeta GSTs具有马来酰乙酰乙酸异构酶（MAAI）活性, 参与苯丙氨酸/酪氨酸的代谢过程。本研究对家蚕Bombyx mori基因组中预测的GST基因（BmGSTz1）进行了表达序列标签的搜索, 经拼接后获得一条含有3′和5′非翻译区在内的长度为1 239 bp 的cDNA序列, 其3′端含有AATAAA加尾信号。BmGSTz1基因含有4个内含子, 外显子/内含子边界均符合GT-AG 规则。经TA克隆证实, BmGSTz1基因编码区序列全长648 bp, 共编码215个氨基酸。BmGSTz1推定的分子量为24.8 kD, 等电点pI为8.06。BmGSTz1与其他昆虫和哺乳动物GSTz1的氨基酸序列高度保守, 进化分析表明家蚕BmGSTz1与黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、意大利蜜蜂Apis mellifera和赤拟谷盗Tribolium castaneum的GSTz1形成1∶1∶1∶1∶1的直系同源关系。RT-PCR和基因芯片数据表明BmGSTz1在家蚕5龄第3天幼虫各组织中都有表达。序列和组织表达特征分析结果提示家蚕BmGSTz1可能具有MAAI活性, 这将为进一步深入研究BmGSTz1基因的功能提供参考。     

家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究

组织蛋白酶D (cathepsin D,CtD)是溶酶体内天冬氨酸内切蛋白酶,参与机体多种生理病理过程,尤其在昆虫的发育变态过程中起着重要作用。利用NCBI上登录的组织蛋白酶D基因核酸序列和家蚕Bombyx mori表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库,进行电子克隆获得家蚕组织蛋白酶D (BmCtD) 基因的全长cDNA (DQ010007)。该cDNA大小为1 543 bp,其中ORF长1 152 bp,同源性分析表明BmCtD与其他物种的CtD具有较高的相似性。BmCtD的mRNA存在选择性拼接,另外一种mRNA形式命名为BmCtDⅠ。RT-PCR实验表明该基因在本实验所调查的家蚕不同发育时期和组织中都有表达。     

烟夜蛾性信息素结合蛋白2(PBP2)基因的克隆、序列分析与时空表达

性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在昆虫雌雄间信息交流中起着重要作用。 本研究利用RT-PCR和RACE方法, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta (Guenée)雄虫触角中克隆了性信息素结合蛋白2基因的开放阅读框及3′末端序列, 该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明, HassPBP2开放阅读框全长450 bp, 编码149个氨基酸残基, 推测编码蛋白的分子量为16.9 kD, 等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明, 该基因由3个外显子和2个内含子组成, 内含子的长度分别为90和261 bp。氨基酸序列联配分析表明, 此序列具有气味结合蛋白的典型特征, 与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%~91%之间, 其中与棉铃虫Helicoverpa armigera PBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescens PBP2的序列一致性高达91%。时间表达和组织表达分析显示, HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达, 在蛹中期开始表达, 并一直持续到成虫中期, 且只在雌、雄成虫触角中表达。     

棉铃虫HaKettin1基因的全长cDNA克隆、序列分析和表达谱

【目的】为了克隆棉铃虫Helicoverpa armigera编码肌肉蛋白Kettin基因的全长cDNA序列以及鉴定该基因在棉铃虫发育周期内的表达模式。【方法】利用兼并引物,通过分段RT-PCR和5′-和3′-RACE的方法克隆全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR进行表达谱分析。【结果】编码棉铃虫Kettin蛋白的基因HaKettin1全长cDNA序列为13 805 bp,包含一个13 365 bp的开放阅读框,编码4 454个氨基酸,蛋白分子量约为504.3 kD。组织表达结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个生育周期都有表达,幼虫期的表达尤为显著。【结论】HaKettin1与家蚕的Kettin蛋白具有90％的同源性,表明鳞翅目昆虫的Kettin蛋白之间具有很高的保守性。表达谱结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个发育过程中都发挥重要作用。     

家蚕先天免疫基因 Bmimd 的克隆、表达及序列分析

昆虫的先天免疫应答由一组基因通过级联网络调控实现。果蝇 Drosophila 免疫缺陷(immune deficiency, imd)基因在体液免疫信号传递途径中起着重要的作用。我们利用生物信息学方法进行电子克隆,成功地找到了 imd 基因在家蚕 Bombyx mori 中的同源体,命名为 Bmimd。该基因全长1 092 bp,由 4 个外显子和 3 个内含子组成,开放阅读框(open reading frame, ORF)长 750 bp,编码 250 个氨基酸,预测蛋白质分子量为 28.6 kD。Bmimd 序列中含有一个致死结构域,经聚类分析表明该结构域与哺乳动物的受体相互作用蛋白(receptor interacting protein, RIP)相似。将该基因亚克隆到 PET-50b 载体进行原核表达,表达出了带有 2 个 6×His tag 和 1 个 Nus·Tag 标签的重组蛋白。Western blotting 结果表明 Bmimd 蛋白在 5 龄 4 天家蚕的头、脂肪体 、生殖腺、表皮和中肠中都有表达,但丝腺中没有检测到表达。     

家蝇微生物感染对RNA干扰GNBP3基因的作用

为了研究家蝇Musca domestica微生物感染对RNA干扰GNBP3基因的作用,评价微生物感染后对下游抗菌肽水平的影响,本研究用RNA干扰技术沉默家蝇GNBP3基因探索最佳沉默时间及效果,检测RNA干扰后家蝇幼虫存活及化蛹情况,通过微生物喂食途径感染,采用实时荧光定量PCR方法检测抗菌肽基因(cecropins、...     

家蝇新型抗菌肽Muscin的基因克隆、表达模式及抑菌活性

【目的】鉴定家蝇 Musca domestica (Linnaeus)中一种新型抗菌肽(Muscin)基因,并分析其功能。【方法】通过数字基因表达谱和生物信息学分析,在家蝇转录组中筛选得到一条抗菌肽基因,命名为 muscin。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的组织分布以及用大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus混合细菌刺激后的表达量变化。并对合成肽Muscin进行抑菌活性检测及溶血率测定。【结果】muscin基因cDNA序列全长379 bp,包含完整的开放阅读框153 bp。推导Muscin多肽序列由50个氨基酸残基组成,N端含有由25个氨基酸残基组成的信号肽。成熟肽中富含疏水性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基,理论等电点为9.39。基因定量结果显示 muscin 基因在血细胞和脂肪体中表达量最高。通过细菌刺激进行免疫诱导后,幼虫体内该基因的表达水平明显上调,并在6 h达到高峰。抑菌和溶血实验显示c-Muscin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,且溶血活性较低。【结论】Muscin是一种新型的广谱抗菌肽,可能参与家蝇抗菌免疫反应,且具有一定药物开发潜质。     

家蝇Denfensin-1基因的克隆、诱导表达及启动子活性分析

【目的】鉴定一种新的家蝇Musca domestica防御素基因, 并分析其功能。【方法】从家蝇转录组数据库中鉴定了1条新的防御素基因cDNA序列, 并将其命名为家蝇防御素1 (Md-defensin-1)基因Mdde-1。利用生物信息学网站、 软件预测其结构等信息。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的表达模式, 并且利用基因步移技术获得了启动子序列, 同时采取细胞转染技术验证Mdde-1启动子活性。【结果】该序列包含一个276 bp的开放阅读框, 编码91个氨基酸残基。推导的氨基酸序列N端包括1个23个氨基酸残基的信号肽和1个28个氨基酸残基的前肽。成熟肽由40个氨基酸残基组成, 含有1个典型的CSαβ基序。实时荧光定量PCR结果显示, 家蝇2龄幼虫受金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (G+)刺激后Mdde-1表达明显上调, 而大肠杆菌Escherichia coli (G^-)刺激后表达下调;Mdde-1在家蝇幼虫受到热激时呈上调表达。为进一步研究其调控机制, 克隆了Mdde-1启动子, 并证明了该启动子具有活性。【结论】据此认为Mdde-1是一种新的家蝇防御素, 并且在免疫革兰氏阳性菌方面发挥重要作用; 同时我们首先证明了Mdde-1的启动子具有活性。本研究为进一步研究家蝇防御素的作用机制奠定了基础。     

毛竹PsbS基因的克隆及其原核表达特征研究

采用RT-PCR技术从毛竹(Phyllostachys edulis)叶片中克隆到1个PsbS基因,命名为PePsbS (GenBank No. FJ600727),其编码区为810 bp,编码269个氨基酸。序列分析表明,PePsbS编码的蛋白与其它单子叶植物的PsbS蛋白有很高的相似性。蛋白结构分析表明,PePsbS基因编码蛋白包含导肽部分和成熟蛋白,其中成熟蛋白包含4个跨膜结构域。将PePsbS基因编码成熟蛋白的序列构建到原核表达载体pET23a中,并转入大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达。结果表明, 41℃下诱导4 h的表达效果最好,目的蛋白含量约占总蛋白的21.5%,分子量约为22.0 kD。这说明温度和诱导时间明显影响PePsbS基因的表达。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶B基因的克隆及表达分析

为研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)组织蛋白酶B(Cathepsin B, CatB)基因的表达特征和功能, 应用RT-PCR和RACE技术获得卵形鲳鲹CatB(TroCatB)基因的全长cDNA。TroCatB cDNA全长为2181 bp。其中5′UTR和3′UTR分别为391和797 bp, ORF为993 bp, 推定编码330个氨基酸残基, 推定分子质量和理论等电点分别为36.37 kD和5.73。蛋白结构预测TroCatB蛋白具有信号肽(1Met-18Ala)、前体肽(25Leu-64Gly)和一个典型木瓜蛋白酶家族半胱氨酸结构域, 含107Cys、277His、297Asn 3个蛋白酶催化活性位点。同源性分析显示TroCatB蛋白与其他脊椎动物的同源性为67.0%—90.9%, 成熟肽区与其他脊椎动物的同源性为73.7%—92.4%。NJ系统发育树显示卵形鲳鲹和其他鱼类聚为一支, 与髙体鰤距离最近。实时荧光定量PCR检测TroCatB基因mRNA在健康卵形鲳鲹各组织中均有表达, 在脾脏中表达最高; 在溶藻弧菌感染后, TroCatB基因在脾脏、头肾组织中的mRNA表达水平显著上调(P<0.05), 脾脏在感染6h后, 其表达量达到峰值, 头肾则是在12h达到峰值。以上结果表明, TroCatB蛋白的结构域和催化活性位点在遗传进化过程中保守, TroCatB基因参与了机体对细菌免疫的相关生理活动, 在卵形鲳鲹先天性免疫防御中发挥重要作用, 为进一步阐明TroCatB在免疫过程中的功能以及其对病原的抗病机理提供参考。     

Tissue inhibitor of metalloproteinase gene from pearl oyster Pinctada martensii participates in nacre formation

Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) are nature inhibitors of matrix metalloproteinases and play a vital role in the regulation of extracellular matrix turnover, tissue remodeling and bone formation. In this study, the molecular characterization of TIMP and its potential function in nacre formation was described in pearl oyster Pinctada martensii. The cDNA of TIMP gene in P. martensii (Pm-TIMP) was 901 bp long, containing a 5′ untranslated region (UTR) of 51 bp, a 3′ UTR of 169 bp, and an open reading fragment (ORF) of 681 bp encoding 226 amino acids with an estimated molecular mass of 23.37 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.42; The predicted amino acid sequence had a signal peptide, 13 cysteine residues, a N-terminal domain and a C-terminal domain, similar to that from other species. Amino acid multiple alignment showed Pm-TIMP had the highest (41%) identity to that from Crassostrea gigas. Tissue expression analysis indicated Pm-TIMP was highly expressed in nacre formation related-tissues, including mantle and pearl sac. After decreasing Pm-TIMP gene expression by RNA interference (RNAi) technology in the mantle pallium, the inner nacreous layer of the shells showed a disordered growth. These results indicated that the obtained Pm-TIMP in this study participated in nacre formation.     

A thioredoxin response to the WSSV challenge on the Chinese white shrimp, Fenneropenaeus chinensis

Thioredoxin (TRX) is involved in cell redox homeostasis. In addition, it is responsible for maintaining proteins in their reduced state. In our study, a Fenneropenaeus chinensis thioredoxin (FcTRX) gene was identified from the Chinese white shrimp. The full length of FcTRX was 777 bp, including a 60 bp 5′ untranslated region (UTR), a 318 bp open reading frame (ORF) encoding a 105 amino acids protein, and a 399 bp 3′ UTR. FcTRX contained a TRX domain with a conserved motif of Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC). No signal peptide was predicted by SMART analysis. The molecular mass and pI of FcTRX were 12 kDa and 4.62, respectively. FcTRX is a widely distributed gene, and its mRNA is detected in hemocytes, hearts, hepatopancreas, gills, stomach, and intestine from an unchallenged shrimp. The expression level of FcTRX was the highest in hepatopancreas, where it was down-regulated to the lowest level at 12 h white spot syndrome virus (WSSV) challenge. In the gills, it went up to the highest level at 6 h. Western blot showed that FcTRX protein in hepatopancreas challenged with WSSV was down-regulated from 2 h to 12 h and then restored to the level similar to that of unchallenged shrimp at 24 h. In the gills challenged with WSSV, the FcTRX protein was up-regulated from 6 h to 24 h. Our research indicated its possible role in the anti-WSSV innate immunity of shrimps.     

The receptor guanylate cyclase Gyc76C and a peptide ligand, NPLP1-VQQ, modulate the innate immune IMD pathway in response to salt stress

Receptorguanylate cyclases (rGCs) modulate diverse physiological processes including mammalian cardiovascular function and insect eclosion. The Drosophila genome encodes several receptor and receptor-like GCs, but no ligand for any Drosophila rGC has yet been identified. By screening peptide libraries in Drosophila S2 cells, the Drosophila peptide NPLP1-VQQ (NLGALKSSPVHGVQQ) was shown to be a ligand for the rGC, Gyc76C (CG42636, previously CG8742, l(3)76BDl, DrGC-1). In the adult fly, expression of Gyc76C is highest in immune and stress-sensing epithelial tissues, including Malpighian tubules and midgut; and NPLP1-VQQ stimulates fluid transport and increases cGMP content in tubules. cGMP signaling is known to modulate the activity of the IMD innate immune pathway in tubules via activation and nuclear translocation of the NF-kB orthologue, Relish, resulting in increased anti-microbial peptide (AMP) gene expression; and so NPLP1-VQQ might act in immune/stress responses. Indeed, NPLP1-VQQ induces nuclear translocation of Relish in intact tubules and increases expression of the anti-microbial peptide gene, diptericin. Targeted Gyc76C RNAi to tubule principal cells inhibited both NPLP1-VQQ-induced Relish translocation and diptericin expression. Relish translocation and increased AMP gene expression also occurs in tubules in response to dietary salt stress. Gyc76C also modulates organismal survival to salt stress - ablation of Gyc76C expression in only tubule principal cells prevents Relish translocation, reduces diptericin expression, and reduces organismal survival in response to salt stress. Thus, the principal-cell localized NPLP1-VQQ/Gyc76C cGMP pathway acts to signal environmental (salt) stress to the whole organism.