黑线姬鼠种群结构与携带汉坦病毒相关性

汉坦病毒(Hantavirus,HV)是肾综合症出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)的主要病原体之一,HV的主要宿主动物为黑线姬鼠(Apodemus agrarius).针对西安市HFRS的持续高发病率,2010年7月-9月对西安市HFRS 疫区捕获的110只黑线姬鼠(阳性62只)进行年龄、性别鉴定.通过病毒RNA提取分析,发现黑线姬鼠雌雄个体携带病毒无显著差异,但是不同年龄段黑线姬鼠携带汉坦病毒却具有显著差异,年龄结构与病毒携带具有极显著的相关性.     

蓝舌病毒血清5型毒株S7基因编码区的分子克隆与序列分析

目的:对蓝舌病毒(BTV)血清5型毒株(BTV-5)的S7基因编码区(ORF)进行克隆和序列分析。方法:用TRIzol LS试剂提取病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增BTV-5型毒株S7基因的编码区,将扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体上,对阳性克隆进行核苷酸序列测定;采用DNAStar和DNASIS v2.5软件对环状病毒属不同种群的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列进行同源性及系统进化树分析。结果:克隆的基因片段长1050bp,为S7基因开放性读码框的全长序列,编码349个氨基酸残基;与环状病毒属不同血清型毒株比较,核酸序列同源性范围为42.2%～96.6%,推导的氨基酸序列同源性范围为40.4%～99.7%。结论:蓝舌病毒与非洲马瘟病毒、鹿流行性出血热病毒分属于不同种群,群内不同血清型的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列显示出很高的同源性,而不同种群之间的同源性很低。     

黑龙江省大林姬鼠中汉坦病毒的分离及其S基因序列分析

为了研究黑龙江省大林姬鼠携带汉坦病毒(HV)的分子特征,对黑龙江省大林姬鼠分离株NA33的S基因进行了扩增和序列分析。结果表明,NA33株S基因全长由1 693nt组成,TA含量丰富,编码N蛋白的ORF起始于37nt,终止于1 326nt,编码的蛋白长429aa,符合HTN型编码。与HV参考毒株进行比较,NA33与Amur类汉坦病毒同源性最高,与其它HTN型相对较低,与SEO等同源性更低。N蛋白进化树分析表明,NA33位于Amur类病毒所在支系,并且与俄罗斯远东和吉林大林姬鼠分离株亲缘关系更接近,体现了一定的宿主依赖性和地理簇集性。序列分析发现,NA33的N蛋白具有Amur类汉坦病毒保守的氨基酸位点。黑龙江省大林姬鼠携带Amur类汉坦病毒,是重要的传染源。     

麻疹病毒F基因测序及其进化关系的初步分析

研究麻疹病毒疫苗株S191毒种及其传代的病毒溶血素F(Haemolysin,HL)基因稳定性;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,推测其功能结构及生物学活性变化;同时对该基因与M蛋白基因之间的非编码序列进行比对分析。利用RT-PCR方法扩增S191减毒株MeV23、26、27代及一株流行株YunnanLC-10的F基因,测序后进行比对分析。S191传代病毒F基因序列之间核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.5%～99.6%;S191疫苗株与流行株之间核苷酸序列同源性达95.2%;疫苗株与流行株1003nt的非编码区序列同源性为85.0%。S191传代病毒F基因具有较高遗传稳定性,关键功能位点氨基酸未发生传代改变;1003nt非编码区序列变异速度较快。     

肠道病毒ECHO25河南分离株基因特征分析

首次对ECHO25病毒进行分子生物学分析,阐明ECHO25(Entric Cytopathic Human Orphanviruses Type25)病毒河南分离株的分子生物学特征及其与世界其它分离株的基因关系。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP1蛋白编码基因并进行序列测定,将所测4株ECHO25病毒的VP1序列与GenBank上已发表的ECH-O25病毒VP1区进行同源性比较及遗传进化分析发现:河南省4株ECHO25与标准株JV-4核苷酸同源性为79.2%～80.1%,氨基酸同源性为89.0%～92.4%;河南省4株ECHO25核苷酸同源性为93.0%～99.0%,氨基酸同源性为92.4%～97.5%;HN-01分离株与HN-26分离株高度同源,其核苷酸同源性达99.0%;河南省4株ECHO25同属B1基因亚型。     

陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%～99.7%、氨基酸同源性范围99.2%～100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%～88.9%、氨基酸同源性范围96.3%～97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%～88.1%、氨基酸同源性范围96.7%～97.6%。分析09年（陕南地区）分离株与18年（关中地区）分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%～2.9%、氨基酸差异率为0%～0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,...     

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

2013年至2018年辽宁省柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征分析

为了解辽宁省地区手足口病患者中分离到的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A10型VP1区基因特征,收集了2013年至2018年辽宁省14个市送检的手足口病患者非EV-A71和非CV-A16肠道病毒的阳性标本,通过细胞培养法分离肠道病毒,提取病毒RNA;通过RT-PCR法进行肠道病毒VP1区基因扩增和序列测定;利用BLAST对测序结果比对后确定病毒基因型;对鉴定为CV-A10的分离株进行VP1区同源性分析,并构建系统进化树。2013年至2018年辽宁省共收到非EV-A71和非CV-A16其他肠道病毒的阳性标本9 431份,用人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells, RD)分离出CV-A10 165株。CV-A10分离株间的VP1区基因核苷酸同源性为91.3%～100%,氨基酸同源性为93.9%～100%,和A、B、C、D各基因型之间的VP1区同源性比较,与C基因型代表株的同源性最高,核苷酸同源性为92%～100%,氨基酸同源性为93.9%～100%。系统进化树分析表明,辽宁省CV-A10分离株为C基因型。CV-A10是引起辽宁省手足口病的重要病原体,CV-A10分离株与C基因型代表株处于同一分支上均属C基因型,有C1和C2两个进化分支共同流行,其中C2分支是优势流行株。     

贵州省25株狂犬病病毒核蛋白基因序列分析

分析贵州省25株狂犬病病毒的核蛋白基因(N基因)序列,探讨贵州省狂犬病流行特征与狂犬病病毒变异情况。以RT-nested PCR检测来自贵州省2005年至2010年不同地区的病人脑组织、病人唾液以及犬脑组织标本狂犬病病毒RNA,经测序与拼接后得到25条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析。25株狂犬病病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为89.3%～100%和98.%～100%;与国内其他省已发表基因1型狂犬病病毒核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88%～99.1%和88%～99.7%,与已知的基因1型狂犬病病毒比较,25株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代。进化树分析显示,同一地区内与相邻地区,以及同一时间段与相邻时间段内狂犬病病毒N基因进化亲缘关系相近。25株贵州省狂犬病病毒流行毒株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,且这些变异具有地域和时间分布特性。     

黑线仓鼠FSHβ基因外显子3部分序列的克隆与分析

根据GenBank数据库中黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)同源物种的FSHβ基因设计引物,利用PCR法在山东省沂南、临朐和曲阜3个地理种群随机选取的黑线仓鼠个体中克隆出FSHβ基因的部分外显子3,序列长度为775bp(GenBank登录号:GQ456067)。该序列与其他物种相应区域的同源性比较结果显示:黑线仓鼠与人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、羊(Ovis aries)等物种核苷酸序列的同源性为80%～96%,氨基酸序列的同源性为79%～100%。系统进化分析结果与物种亲缘关系的远近一致,说明该研究所得到的FSHβ基因序列可作为研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记。     

荷包猪SLA-DRB基因cDNA的克隆及分子进化特征分析北大核心CSCD

旨在研究荷包猪SLA-DRB基因的分子特征,设计引物用RT-PCR扩增3头荷包猪DRB基因c DNA,并克隆至p MD18-T Vector,阳性克隆测序并做序列分析,分别进行同源性、分子进化及主要氨基酸变异位点分析。结果表明,成功从3头荷包猪中扩增得到SLA-DRB基因,分别命名为SLA-DRB-HB01-03,经序列测定后,证实c DNA全长为836 bp,其中1-801为ORF区,共编码266个氨基酸。同源性分析显示,SLA-DRB-HB与其他SLA-DRB等位基因的同源性介于90.3%-99.8%之间。分子进化分析表明,荷包猪SLA-DRB-HB独立分支,与其他等位基因相比较,进化更加原始。氨基酸变异位点和多态性分析结果显示,SLA-DRBHB本身存在一定的多态性。     

手足口病病例肠道病毒CVA12型的鉴定及VP1基因特征分析

目的运用分子生物学方法对长沙市1例手足口病(Hand foot and mouth Disease,HFMD)患者咽拭子标本进行未分型肠道病毒的鉴定及VP1基因特征分析。方法采用兼并引物RT-PCR扩增病毒VP1区片段,BLAST比对确定其型别;特异性引物扩增VP1区基因全长,测定序列进行分析。结果所得序列BLAST比对分析为Coxsackievirus A12(CVA12)型肠道病毒;病毒VP1区基因序列全长为888bp,编码296个氨基酸,同源性分析显示与国内外CVA12毒株核苷酸同源性介于81.9%~98.4%之间;氨基酸同源性在95.3%~100.0%之间。与CVA12美国标准株Texas-12核苷酸同源性为81.9%,氨基酸同源性为95.3%。系统进化表明,长沙市CVA12与国内毒株亲缘关系较近,而与日本、美国则亲缘关系较远。结论从1例手足口病轻症病例中鉴定出CVA12型肠道病毒,该病毒VP1区基因进化特征与国内CVA12毒株亲缘关系近。     

广东省阿卡斑病毒和OYAV的检测及分子特征研究

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)和Oya病毒(Oya virus,OYAV)均属于泛布尼亚病毒科、正布尼亚病毒属的两种病毒,可引起动物疾病,目前广东省尚不清楚是否存在这两种病毒。为了解这两种病毒在广东省的存在状况及分子特征,2018年4月至7月,分别在广东省的佛山、信宜、河源和阳江四个地市利用人诱法和诱蚊灯法采集吸血昆虫标本。采集的标本分类后,按20～50只/批,蠓虫按200～500只/批分装,液氮保存运输。标本破碎离心后,上清用于接种细胞和病毒核酸提取。Real-time RT-PCR检测AKV和OYAV阳性的样本用于S基因的扩增、测序和系统进化分析。本次研究共采集各类吸血昆虫421批次,Real-time RT-PCR检测AKV阳性10份,均来自蠓虫标本,RT-PCR检测AKV阳性5份,其中4份成功测序;Real-time RT-PCR检测OYAV阳性15份,其中蠓虫13份、中华按蚊和三带喙库蚊各1份,RT-PCR检测OYAV阳性6份,其中4份成功测序。病毒分离结果均为阴性。进化分析结果显示,所有序列共分为5个血清群,本次研究的8条序列均位于Simbu群,其中4个新毒株与OYAV代表株NIV86209的核苷酸同源性最高可达96.87%,氨基酸同源性最高为100%;另外4株新病毒与AKV代表株GXLCH02的核苷酸同源性最高达98.60%,氨基酸同源性最高为99.57%。本研究结果揭示,AKV和OYAV在广东省的虫媒中分布广泛,主要以蠓虫分布为主,来自蠓虫中的新OYAV和AKV与其它媒介或宿主中的AKV和OYAV高度同源,未显示明显媒介差异的分子特征。     

河北省儿童病毒性脑炎及脑膜炎埃可病毒30型VP1基因特征分析

为了解河北省儿童病毒性脑炎和脑膜炎患者中埃可病毒30型(Echovirus 30,E30)流行株基因特征及进化。本研究对2013～2015年间河北省儿童病毒性脑炎和脑膜炎病例中151份鉴定为肠道病毒阳性的脑脊液标本进行血清型鉴定,扩增E30流行株VP1区全基因序列;并与GenBank下载的325株E30的VP1基因序列进行同源性及亲缘关系分析。共获得18条E30 VP1基因序列。亲缘性分析显示E30可分为A～H 8个基因型;我国E30流行株主要为D、E、G和H基因型;本研究中E30流行株均为H基因型。18条E30 VP1基因核苷酸同源性为93.3%～100%,氨基酸同源性为98.2%～100%,与原型株(Bastianni)核苷酸和氨基酸同源性分别为80.9%～81.1%和91.4%～92.4%。该研究中18株E30与我国浙江省和山东省的分离株核苷酸和氨基酸同源性最高。2013～2015年间引起河北省儿童病毒性脑炎和脑膜炎的E30流行株为H基因型,可能存在多个传播链。     

荷包猪SLA-DRB基因cDNA的克隆及分子进化特征分析

旨在研究荷包猪SLA-DRB基因的分子特征,设计引物用RT-PCR扩增3头荷包猪DRB基因c DNA,并克隆至p MD18-T Vector,阳性克隆测序并做序列分析,分别进行同源性、分子进化及主要氨基酸变异位点分析。结果表明,成功从3头荷包猪中扩增得到SLA-DRB基因,分别命名为SLA-DRB-HB01-03,经序列测定后,证实c DNA全长为836 bp,其中1-801为ORF区,共编码266个氨基酸。同源性分析显示,SLA-DRB-HB与其他SLA-DRB等位基因的同源性介于90.3%-99.8%之间。分子进化分析表明,荷包猪SLA-DRB-HB独立分支,与其他等位基因相比较,进化更加原始。氨基酸变异位点和多态性分析结果显示,SLA-DRBHB本身存在一定的多态性。     

重组CHO细胞C_(28)株S基因序列的测定及分析

目的测定重组CHO细胞C28株S基因序列,研究其遗传稳定性,并与已全基因序列测定的乙型肝炎病毒的S基因序列进行比较分析,预测和揭示现有疫苗株对当前疾病流行株的防病效果。方法从C28株中选取第22代、24代2、5代2、7代、28代2、9代3、0代、31代3、2代3、3代和34代细胞,根据GenBank中C基因型adr亚型乙型肝炎病毒的全基因序列设计引物。采用酚-氯仿法抽提CHO细胞基因组DNA,用PCR法扩增各代次细胞的S基因,回收700 bp左右的目的片段,克隆至pMD18-T载体上进行序列测定。利用生物学软件MEGA4.1和BioEdit进行S基因序列同源性分析,绘制系统进化树,分析与其他HBV病毒株S基因的同源性。应用实验动物测定C28株生产的重组乙型肝炎疫苗的效价。结果 C28株十一个代次之间S基因序列核苷酸和氨基酸同源性均为100%;C28株十一个代次S基因与其他病毒株S基因比较,与C基因型乙型肝炎病毒同源性最高,与其他基因型乙型肝炎病毒的核苷酸同源性达91.4%～95.1%,氨基酸同源性达84.5%～93.3%。免疫NIH小鼠结果显示5批重组乙型肝炎疫苗的效价均符合标准。结论 C28株S基因在传代及保存过程中具有较高的稳定性,对当前疾病流行株有较好的防病效果。     

家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析

对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险。9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析。共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/Hubei/w h/1999)aa同源性分别为90.1%～92.5%和91.0%～92.6%,8个H5N1的NS1和NS2aa之间的同源性分别为93.8%～100.0%和98.4%～100.0%。8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征。家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒。     

蓝舌病毒野毒株及疫苗株S10基因多态性分析研究

对中国蓝舌病毒1株疫苗株、31株野毒株及1株南非毒株进行测序。结果揭示33株毒株S10基因核苷酸长度均为822bp,S10基因为基因内基因,其核苷酸链的第20～22和59～61位有两个起始密码子,共有终止子在707～709位,预测编码NS3和NS3A两种蛋白;32株中国毒株间核苷酸差异0～107个,同源性86%～100%; NS3蛋白氨基酸差异0～10个,同源性956%～100%。测序毒株与GenBank中9株其它毒株比较,建立的S10基因系统发生树,将蓝舌病毒分为China group和US group两大基因群,两大群的同源性为85%;US group包括美国8株及南非1株毒株;China group包括中国32株及澳大利亚1株毒株;说明蓝舌病毒S10基因分群与毒株的地理区域来源有关。在国内首次进行了全国较大范围内蓝舌病毒分子流行病学调查,揭示了我国蓝舌病毒毒株的遗传多样性。     

阿卡斑病毒云南分离株全基因组序列特征研究

为阐明分离自云南省的蚊媒阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)DHL10M110株(简称云南株)的分子生物学特征,采用RT-PCR和核苷酸序列测定方法,对云南株进行全基因组序列测定和分析。结果获得了云南株全基因组核苷酸序列,该病毒株的L、M和S基因核苷酸序列全长分别为6 869bp、4 309bp和856bp,其中开放读码框(Open reading frame,ORF)核苷酸序列依次为6 756bp、4 206bp和702bp,并分别编码2252、1402和234个氨基酸。这三个基因片段ORF的系统进化分析表明,云南株L基因与AKV标准株OBE-1(日本)和AKVS-7/SKR/2010株(韩国)处于同一进化分支;在M和S基因进化树中,云南株与日本、韩国和台湾地区的AKV流行株亲缘关系较近,但云南株单独处于一个小的进化分支。同源性分析表明,云南株L、M和S片段ORF与OBE-1株的核苷酸(氨基酸)同源性分别为92.6%(98%)、88.5%(94%)和96.4%(99.1%)。云南株与OBE-1株的L、M和S片段分别有45、84和2个氨基酸位点的差异。此外,无论L、M和S基因核苷酸序列的同源性或系统进化分析均表明,云南株与肯尼亚和澳大利亚AKV分离株进化关系较远,同源性较低。本研究进一步通过病毒全基因组序列分析证实DHL10M110病毒株为AKV,属亚洲进化群,但与日本和韩国株相比仍有一定差异,云南株地域特征明显。这是首次在中国大陆地区测定到该病毒的全基因组序列。