柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

抗凝剂EDTA-Na2对家禽血液指标及基因组DNA的影响

[摘要]目的：分析不同浓度的抗凝剂EDTA-Na2对家禽血液指标及基因组DNA抽提的影响。方法：采集鸡血,分别加入0．6（A组）、0．9（B组）、1．2（C组）、1．5（D组）、1．8（E组）和2．1（F组）mg／mL的EDTA-Na2,立即检测白细胞总数（WBC）、淋巴细胞（LYM）、中间细胞（MID）、粒细胞（GRAN）、红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HGB）、血红蛋白含量（MCH）和血小板总数（PLT）,用SPSS软件分析检测数据;用酚-氯仿法提取添加不同量抗凝剂的血液基因组DNA,并进行PCR扩增,基因组DNA和PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。结果：A组样品出现肉眼可见的凝块,B组有2／7样品有凝集现象,C、D、E和F组均无凝集现象。A组凝集现象严重无法进行血液指标测定,其余5组样品中,对于RBC和HGB指标,C组与B组相比无显著性差异,与D、E、F组差异极显著（P〈0．01）;对于PLT,C组与B组相比无显著性差异,与D、E、F组差异显著（P〈0．05）;WBC无显著变化。除A组外,各组均能获得质量较好的基因组DNA,并能扩增出目的条带。结论：除A组外,不同浓度的EDTA-Na2对基因组DNA提取和PCR扩增无影响。以EDTA-Na2作为禽血抗凝剂时,建议用量应不低于1．2mg／mL。     

不同培养代次对经血源子宫内膜干细胞生物学活性的影响

该研究明确了不同培养代次经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood derived endometrial stem cells,MenSCs)的生物学活性差异,为深入研究MenSCs生物学特性及其潜在临床应用提供理论支持。该研究使用钙黄绿素AM(Calcein-AM)染色检测体外培养至第三代(passage 3,P3)、P9和P15代MenSCs的形态;β-半乳糖苷酶染色检测不同培养代次MenSCs的衰老程度;活性氧试剂盒检测不同培养代次MenSCs中活性氧的变化;随后利用MTT、流式细胞术及细胞活死染色在接触式共培养条件下检测P3、P9和P15代MenSCs对小鼠脾淋巴细胞活性、细胞周期、死亡情况以及脾脏淋巴细胞中CD3^+和CD19^+淋巴细胞比例的影响。结果表明,随着培养代次的增加MenSCs细胞面积显著增大,在培养至P15代时MenSCs开始出现大量丝状伪足。衰老程度及活性氧的含量也随培养代次的增加而显著升高;随后与MenSCs接触式共培养体显著增加了小鼠脾淋巴细胞的活性,降低淋巴细胞死亡率,且随培养代次的增加,MenSCs对促进淋巴细胞存活、降低死亡的能力显著降低;进一步细胞周期检测发现,MenSCs无刺激淋巴细胞增殖分裂活性,但可显著降低淋巴细胞死亡及碎片化,且培养代次的增加可显著降低MenSCs维持淋巴细胞存活的能力;此外,不同培养代次MenSCs在体外均对小鼠脾淋巴细胞中CD3^+和CD19^+细胞亚群百分比无显著性影响。综上,MenSCs随着体外培养时间和代次的增加,出现明显的生物学活性降低等特征,且对淋巴细胞活性的调节能力显著降低,上述结果为临床应用中保障MenSCs质量、平衡细胞培养代次和细胞数量及保证稳定的MenSCs临床治疗效果提供理论支持。     

金黄色葡萄球菌类肠毒素K与GFP融合蛋白工程菌的构建及其表达蛋白生物学活性分析

目的:构建携带金黄色葡萄球菌类肠毒素K(staphylococcal enterotoxin-like K,SElK)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因的工程菌,并对SElK-GFP融合蛋白进行初步生物学活性分析。方法:利用PCR和Overlap PCR克隆获得SElK-GFP融合基因,并插入pET28a表达载体中,通过菌落PCR,质粒双酶切及测序验证后,将构建成功的pET28a-SElK-GFP质粒转化到E. coli BL21菌株中进行诱导表达,通过Ni+亲和磁珠试剂盒纯化获得SElK-GFP融合蛋白;并利用MTT法检测SElK-GFP刺激小鼠脾淋巴细胞增殖; ELISA法检测SElK-GFP尾静脉注射后小鼠血清中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平。结果:成功构建能够表达SElK-GFP融合蛋白的工程菌,纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白可观测到明显的绿色荧光,融合蛋白生物学活性分析表明,SElK-GFP能够呈剂量依赖性地显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;同时ELISA检测发现SElK-GFP可显著增加小鼠血清中细胞因子IL-2及IFN-γ的分泌水平。结论:成功克隆、表达及纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白,其不仅保留了SElK的超抗原活性,同时兼具GFP绿色荧光的可视性,为深入研究SElK生物学活性提供有利工具。