植物质体基因工程:新的优化策略及应用

植物质体转化技术通过同源重组实现定点整合,与细胞核基因工程相比,使外源基因表达更为精确、安全和高效。该技术在基础研究中为叶绿体功能基因组研究提供了有效手段,同时在应用方面为外源基因表达提供了理想的平台,已成为植物遗传育种的一种新策略。本文总结了近年来质体基因工程在转化体系的建立和优化上的新思路,着重阐述了利用质体转化技术在遗传育种中提高作物抗性、改良品质等应用领域的最新研究进展。克服质体转化技术在作物遗传育种中面临的难题,必将为作物育种的发展带来新的绿色革命。     

叶绿体遗传转化研究中的选择标记

叶绿体遗传转化研究需要有合适的选择标记作为辅助手段,多种选择标记已经在叶绿体转化中得到应用。本文综述了国内外叶绿体转化研究中主要使用的选择标记,并着重介绍了非抗生素选择标记－甜菜碱醛脱氢酶和选择标记的删除体系。     

基因甘蔗：潜能、现状和前景

从基因中在甘蔗上的应用潜能、甘蔗遗传转化的方法及其成效、启动子及选择标记对基因表达和转化体筛选的效应,基因工程甘蔗的成就等几个方面进行综述评述,并提出了进一步的研究方向。     

叶绿体基因工程研究进展

叶绿体是植物细胞和真核藻类执行光合作用的重要细胞器,在叶绿体中表达外源基因比在细胞核中表达具有一些独特优势。叶绿体基因工程涉及叶绿体的基因组特征、转化系统的优点、转化过程及方法等方面,叶绿体基因工程在提高植物光合效率、改良植物特性、生产生物药物及改善植物代谢途径等方面已得到应用。尽管叶绿体基因工程还存在同质化难度高、标记基因转化效率较低、宿主种类偏少等问题,但作为外源基因在高等植物中表达的良好平台其仍然具有广阔的发展和应用前景。     

基因工程甘蔗：潜能、现状和前景

从基因工程在甘蔗上的应用潜能、甘蔗遗传转化的方法及其成效、启动子及选择标记对基因表达和转化体筛选的效应、基因工程甘蔗的成就等几个方面进行综合评述,并提出了进一步的研究方向。     

植物质体转化途径及其影响因素

植物质体转化开辟了除核基因组之外的另一条遗传转化途径,10几年来取得了很大的进展。但在更多的植物上实现质体转化仍然存在各种困难。本总结了近年来质体转化在各种植物上的研究进展,并针对影响质体转化成功的因素,从组织培养、转化载体和标记基因等几个角度进行了分析。     

高等植物的质体基因转化

质体基因转化技术由于其独特的优越性,已开始成为植物基因工程中新的研究热点。本文对质体基因转化技术所面临的几个关键性问题,包括外源基因导入方法、外源基因的整合及表达、质体转化体的有效筛选标记等进行了讨论,同时对质体基因转化的优越性及其应用与发展前景进行了综合评述。     

丝状真菌基因工程研究进展

本文评述了丝状真菌基因工程的研究进展,内容涉及已被转化成功的９０余种丝状真中类及其所利用的选择标记,比较了几种外源ＤＮＡ进入丝状真菌受体的方法,并较为详细地评述了丝状真菌复制型与整合型转化及其转化子的有性生殖与无性生殖的遗传稳定性,最后,展望了丝状真菌基因工程在农业,工业和医药方面的应用。表明了丝状真菌基因工程具有广阔的应用前景。     

同质化叶绿体转基因植株的获得

构建了含有外源目的基因表达盒（ｐｓｂＡ５’－ｍｉｆＨ－ｐｓｂＡ３’）和选择标记基因表达盒（Ｐｒｒｎ－ａａｄＡ－ＴｐｓｂＡ）以及两段质体基因组同源片段的烟草叶绿体转化载体ｐＴＲＣＨ２０５。基因枪聂击受试外植体后,经抗生素筛选获得转化再生植株。为探索提高转基因植株同质化程度的可能途径,对再生植株再高浓度的壮观霉素选择压下进行了３轮次分化再生,并结合腋芽繁殖方式继代６￣１０次。ＰＣＲ扩增和以同源片段为探     

叶绿体遗传转化的研究进展

核转化技术是基因工程的主要方法,但其多方面的不安全性使人们把焦点转向了植物基因工程另一目标：叶绿体遗传转化。本文介绍了叶绿体基因及基因组;叶绿体遗传转化的原理和方法：叶绿体转化的优点。重点介绍了关于叶绿体遗传转化国内外研究新进展。     

丝状真菌基因工程研究进展

本文评述了丝状真菌基因工程的研究进展,内容涉及已被转化成功的９０余种丝状真菌种类及其所利用的选择标记,比较了几种外源ＤＮＡ进入丝状真菌受体的方法,并较为详细地评述了丝状真菌复制型与整合型转化及其转化子的有性生殖与无性生殖的遗传稳定性,最后,展望了丝状真菌基因工程在农业、工业和医药方面的应用。表明了丝状真菌基因工程具有广阔的应用前景。     

利用甘薯质体同源片段构建多顺反子表达载体

反子定点整合表达载体pSAG,酶切鉴定结果表明所构建的载体符合预期设计.这为后期甘薯质体转化体系的建立和通过质体基因工程手段将更多目的基因导入甘薯进行遗传改良奠定了基础.     

丝状真菌遗传转化体系的研究进展

随着现代测序技术的飞速发展,主要丝状真菌的基因组序列相继公布,对丝状真菌基因水平的研究也不断深入,发展高效的遗传转化技术是真菌基因功能研究以及定向改良菌种的前提。近年来,尽管研究者不断优化并开发新的遗传转化方法,然而在丝状真菌中仍然存在转化效率较低、阳性转化子筛选困难等问题。适宜的转化方法和筛选标记对丝状真菌的遗传转化有至关重要的作用。该文综述了丝状真菌遗传转化系统的研究进展,主要从受体细胞的处理、外源基因的整合与表达、常用转化方法和阳性转化子的筛选鉴定等方面进行概述,旨在为今后丝状真菌遗传转化体系的构建提供思路。     

微生物遗传转化筛选标记及其生物安全性的研究进展

在分子生物技术中,筛选标记基因是遗传转化载体所必备的基本元件之一,其主要功能是在基因操作中进行目标克隆的筛选,以及在应用过程中通过选择压力维持基因重组性状。抗药基因是微生物遗传转化中常用的筛选标记,大肠杆菌载体和一般穿梭载体中通常带有抗药基因。带有抗药基因的工程菌可以被广泛地应用于酶和有机化学品的发酵生产,因为工业发酵过程是在封闭系统中进行的,并且最终产品需要经过提炼。但是当人们需要用基因改良的菌株进行食品和饲料加工、环境修复、病虫害生物防治时,抗药基因类筛选标记应该被禁止使用。因此,发展生物安全性筛选标记成为遗传转化技术推广应用中的一个技术关键。本文介绍常用作筛选标记的抗药基因,以及针对抗药基因的安全性问题而发展的无选择标记的遗传转化技术及生物安全性筛选标记的基因工程技术。葡萄糖胺合成酶基因是近年发展起来的新型生物安全性筛选标记,它弥补了其他营养缺陷互补型和功能附加型筛选标记的缺陷,具有广阔的应用前景。     

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因(ASA2)作为筛选标记基因,并采用氨基酸的类似物5—甲基色氨酸为筛选剂,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高59％～123％。PCR检测转化子1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物(烟草)编码的邻氨基苯甲酸α—亚基能够与另一种植物(大豆)编码该酶的β—亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。对ASA2基因作为一种新的植物转化筛选标记基因的优缺点进行了讨论。     

昆虫遗传转化品系的常用标记

遗传转化标记是将遗传修饰昆虫从野生型种群中分辨出来的根据,遗传转化昆虫的鉴定、转化品系的维持及其遗传稳定性的监测都依赖于可靠的标记系统,发展易于应用和监测的转化标记能够极大地促进害虫遗传防治的相关研究。用于遗传修饰昆虫的转化标记主要有昆虫眼睛颜色标记基因、抗药性标记基因和荧光蛋白标记基因等。非果蝇类昆虫首个遗传转化品系的鉴定是通过眼睛颜色突变而实现,但大多数昆虫物种没有可用的突变体或缺少相应基因的信息,从而限制了眼睛颜色标记的应用。抗药性基因标记虽然能够通过对转化昆虫进行集体选择而大幅度提高筛选转化体的效率,但由于其鉴定的准确性不高且存在安全性问题,未得到广泛应用。荧光蛋白标记基因的发展则显著拓宽了能够转化的昆虫种类。从水母分离的绿色荧光蛋白(GFP)经突变方法获得了多种不同荧光性质的突变体,经人为修饰后与适宜的强启动子构成转化标记载体,能够有效鉴定更多昆虫物种的遗传转化个体,其中应用较多的是增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。此外,从珊瑚属海葵中分离得到的红色DsRed标记基因提供了多样化的红色荧光蛋白选择,在某些生物中DsRed与GFP联合应用的表现明显优于GFP突变体,所以其应用前景也非常广泛。本文着重从眼睛颜色、抗药性和荧光蛋白等3个方面阐述了标记基因的发展历史与现状,并对其今后的发展方向进行了展望。     

运动发酵单胞菌ZM4、CP4菌株基因工程选择标记的研究

尽管质粒和选择标记的使用作为基因工程最基本的一环而为人们所熟知,但对一些特殊菌种（菌株）或研究很少的菌种（菌株）的基因工程操作来说,质粒和选择标记可能仍然是一个并未完全解决的问题,因而需要不断提高认识、不断改进。运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis具有突出的产醇性能,但其多种内源质粒和多种抗性的特点,增加了其基因工程操作时质粒和选择标记选用的难度。本研究在测定四个抗生素即Ap、Cm、Te、Km对典型菌株ZM4、CP4的最低生长抑制浓度的基础上,初步确定了这两个菌株基因工程操作时的四个抗生素使用浓度依次分别为300、100、25、350μg／mL（ZM4）和500、100、25、250μg]mL（CP4）;并进一步通过穿梭载体pZB21、宽宿主载体pBBR1MCS-2和整合载体pBR328-ldhR—cml—ldhL的转化,初步分析和证明了这些选择标记和在相应抗生素浓度下的效果：首先,对每一个选择标记基因来说,前述抗生素浓度是适于携带此选择标记基因的质粒的转化筛选和相应转化子培养的;其次,在前述抗生素浓度下,综合筛选平板阳性率和转化效率、培养物菌体形态异常程度等指标,四个选择标记基因中,以Cm和Tc抗性标记基因效果最好,Km抗性标记基因居中,Ap抗性标记基因最差。这些结果为ZM4、CP4基因工程遗传改造用抗性标记基因、质粒、抗生素的选择及转化系统的完善奠定了基础。     

叶绿体基因工程：一种植物生物技术的新方法

以叶绿体转化为主的叶绿体基因工程,与传统的基因工程技术细胞核转化相比,在外源基因表达水平和转基因植物安全性等方面有明显的优势, 尤其是在控制转基因沉默和遗传稳定性方面,可以互补核转化带来的局限性。因此,叶绿体基因工程是一种很具有发展前景的植物转基因技术,并在未来工农业生物技术领域发挥重要作用。本文着重在叶绿体转化技术主要特点,应用领域及其未来的发展前景等方面进行了简单评述。     

Studies on selectable marker for genetic engineering of Zymomonas mobilis ZM4 and CP4 strain

尽管质粒和选择标记的使用作为基因工程最基本的一环而为人们所熟知,但对一些特殊菌种(菌株)或研究很少的菌种(菌株)的基因工程操作来说,质粒和选择标记可能仍然是一个并未完全解决的问题,因而需要不断提高认识、不断改进.运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis具有突出的产醇性能,但其多种内源质粒和多种抗性的特点,增加了其基因工程操作时质粒和选择标记选用的难度.本研究在测定四个抗生素即Ap、Cm、Tc、Km对典型菌株ZM4、CP4的最低生长抑制浓度的基础上,初步确定了这两个菌株基因工程操作时的四个抗生素使用浓度依次分别为300、100、25、350μg/mL(ZM4)和500、100、25、250 μg/mL(CP4);并进一步通过穿梭载体pZB21、宽宿主载体pBBR1MCS-2和整合载体pBR328-ldh R-cml - ldhL的转化,初步分析和证明了这些选择标记和在相应抗生素浓度下的效果:首先,对每一个选择标记基因来说,前述抗生素浓度是适于携带此选择标记基因的质粒的转化筛选和相应转化子培养的;其次,在前述抗生素浓度下,综合筛选平板阳性率和转化效率、培养物菌体形态异常程度等指标,四个选择标记基因中,以Cm和Tc抗性标记基因效果最好,Km抗性标记基因居中,Ap抗性标记基因最差.这些结果为ZM4、CP4基因工程遗传改造用抗性标记基因、质粒、抗生素的选择及转化系统的完善奠定了基础.     

利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统

热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力,但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造热带假丝酵母的重要前提。文章以C. tropicalis ATCC 20336为出发菌株,通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷型突变株C. tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因作为靶基因构建了两端包含同源臂并在选择性标记C. tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase,乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisG- PDC1(PHUHP),并转化宿主菌株C. tropicalis XZX,筛选获得PHUHP片段正确整合到染色体的PDC基因位点的转化子XZX02。在此基础上,将转化子XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上,筛选得到URA3基因从PHUHP片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03。进一步构建了第2个PDC等位基因的删除表达盒PDCm- URA3-PDCm,并转化C. tropicalis XZX03菌株,获得转化子C. tropicalis XZX04。经PCR和DNA测序确认转化子C. tropicalis XZX04细胞染色体上的两个PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术,利用该技术成功敲除了细胞的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造热带假丝酵母奠定了基础。