细胞间粘附分子1特异结合肽的筛选及其生物功能

采用两种方法对噬菌体展示随机十五肽库进行亲和淘选 .ELISA法筛选特异结合高亲和力的阳性噬菌体单克隆 ,测序 ,得到 6个与人细胞间粘附分子 1(ICAM 1)高亲和力的噬菌体展示十五肽单克隆 .再经ELISA法从这 6个噬菌体单克隆中选择与ICAM 1亲和力最高的单克隆 ,同时利用蛋白空间结构位象模拟技术对小肽与ICAM 1的亲和力进行模拟研究 .最终获取目的小肽的氨基酸序列为GRGEFRGRDNSVSVV .目的单克隆噬菌体与ICAM - 1的亲和常数Ka 为 7 87× 10 7L mol .体外合成、纯化并标记目的小肽 .ELISA法验证目的小肽与人ICAM 1的结合呈浓度依赖性 ,抗ICAM 1多抗不能拮抗目的小肽与ICAM 1的结合 .采用免疫组化方法证实 ,此目的小肽具有与炎症组织中高表达的ICAM 1特异性结合的功能 .在动物体内 ,荧光标记的目的小肽具有向高表达ICAM 1的炎症部位特异性聚集的功能 .说明此目的肽可尝试作为以ICAM 1为靶的“肽导向药物”的前导肽 .     

骨髓间充质干细胞亲和肽MMP底物肽复合物的构建及其作为小分子药物载体的初步研究

为了探讨骨髓间充质干细胞亲和肽与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）底物肽复合后作为小分子药物载体的可行性,采用噬茵体肽库技术,用分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mousemesenchymalstemcells,MSCs）筛选噬菌体环七肽库,获得MSCs高亲和性多肽．合成FrrC（Frrc—CSTNPKVLC,FITC．P1）和生物素（Biotin—CSTNPKVLC,Bio-PI）标记的亲和肽,流式细胞术和ELISA方法检测其与MSCs的亲和性;将DAPI标记的MSC-Bio-P1复合物植入裸鼠肿瘤组织周围,检测复合物在体内的稳定性．将亲和肽与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）特异性底物肽（GPLGIAGQ）连接,合成FITC标记的亲和肽．底物肽复合物（FITC-Ahx-CSTNPKVLCGPLGIAGQ,FITC—P1-P2）,通过流式细胞术检测其对MSCs的亲和性,毛细管电泳方法检测MMP对FITC-P1-P2的酶切效果．结果表明,通过噬菌体肽库筛选获得的MSCs亲和肽,在体内外对MSCs均具有良好的亲和性和稳定性;亲和肽与底物肽的复合物（FTTC—P1-P2）对MSCs仍有较好的亲和性,并且能够被MMPs酶切．以上研究表明,MSCs亲和肽．MMP底物肽复合物（CSTNPKVLCGPLGIAGQ,P1-P2）可以作为MSCs与小分子药物相连的连接子,从而对MSCs作为小分子药物（如化学药物）载体的可行性提供了实验依据．     

噬菌体展示技术筛选大鼠佐剂性关节炎中PGE2受体的拮抗剂

目的：通过筛选PGE2受体拮抗剂,来探讨其在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）中的作用,为RA的治疗开辟新的途径。方法：应用噬菌体展示技术,以PGE2为靶点,对噬菌体环七肽库进行"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,5轮筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行亲和力鉴定,并选取亲和力高的克隆进行测序并对序列进行分析。合成环七肽后,建立佐剂性关节炎（AA）动物模型,通过分析足爪肿胀度,以及采用ELISA方法检测关节浸液中细胞因子的含量,对小肽的抗炎作用进行探讨。结果：噬菌体经过富集后,随机挑选的23个克隆中有21个阳性克隆,而在测序的8个克隆中4个具有相同的序列,其余也具有保守氨基酸。合成的环七肽能降低AA关节的肿胀度并减少关节浸液中前炎症细胞因子的含量。结论:噬菌体筛选PGE2受体拮抗剂的方法可行,并且得到的环七肽具有一定的抗炎作用。     

从随机噬菌体肽库中筛选抗草鱼出血病病毒多肽的研究

从随机噬菌体九肽表位库中筛选出抑制草鱼出血病病毒（ＧｒａｓＣａｒｐＨｅｍｏｒｈａｇｅＶｉｒｕｓ,ＧＣＨＶ８７３）感染的多肽分子。采用完整、生物素化的草鱼出血病病毒颗粒作为受体,与以融合蛋白形式在丝状噬菌体ｆＵＳＥ５的外壳蛋白Ⅲ的Ｎ端表达的随机九肽库作用。经三轮体外亲和筛选（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）及ＥＬＩＳＡ法检测后,从肽库中筛选出１６个与病毒高亲和力结合的噬菌体克隆,其中六个阳性克隆能有效地抑制病毒在ＣＩＫ细胞中的复制,并使病毒的半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤ５０）下降五个数量级。表明噬菌体肽库技术完全能够应用于抗病毒研究,为研制抗病毒短肽制剂打基础。     

抗体和寡核苷酸双标记纳米金生物探针的制备及性能分析

基于纳米金粒子与抗体静电吸附作用,与硫醇修饰的寡核苷酸共价结合,建立一种新的双标记纳米金生物探针的制备方法.通过透射电镜（TEM）、紫外光谱、斑点免疫金渗滤法、免疫金银染色光镜观察法、荧光标记法等检测探针表征,及表面抗体活性情况和寡核苷酸的覆盖率,同时采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测寡核苷酸的存在.结果表明,纳米金粒子同时连接抗体和寡核苷酸后生物性能良好,且每个纳米金粒子（10±3）nm表面可覆盖寡核苷酸(92±20)条,双标记纳米金生物探针的制备具有简捷、稳定的特点.可作为一种新型探针应用于超微量蛋白质检测.     

应用多重标记引物增强寡核苷酸芯片的荧光信号强度

寡核苷酸芯片技术是一种高通量发掘和采集生物信息的强大技术平台,目前已广泛应用于生物科学领域 . 为改善寡核苷酸芯片的分析性能,对影响芯片杂交结果的因素,如片基表面的化学处理、探针的长度、间隔臂的长度、杂交条件等,进行了深入的研究和优化 . 对寡核苷酸芯片而言,仍有待解决的问题是如何产生更强的荧光信号来改善其检测灵敏度 . 利用两种类型的多个荧光分子标记的引物,来增强二维寡核苷酸芯片平面上的荧光信号强度 . 两种引物分别命名为：多标记线性引物和多标记分支引物 . 通过增加标记在目标 DNA 片段上的荧光分子数,可以显著增强寡核苷酸芯片上相应捕获探针的信号强度 . 实验表明,使用多标记引物能将所用的寡核苷酸微阵列的检测限 ( 以能够检测的最低模板量计算 ) 降低至单荧光标记引物的 1/100 以下,多重标记技术是一种有效增强微型化探针矩阵检测灵敏度的信号放大方法 .     

炎症及炎症耐受模型筛选广谱趋化因子抑制肽

通过减少炎性组织或细胞趋化因子及炎性因子的表达量能将炎症性病理过程抑制在起始阶段．我们通过体外构建人外周血单个核细胞LPS激活的急性炎症模型及内毒素耐受模型,进行噬菌体肽库亲和筛选,ELISA检测与炎性PBMC的结合能力,分泌抑制实验筛选抑制性噬菌体克隆,经趋化抑制、竞争结合及生成抑制实验检测体外活性,大鼠足肿胀及关节炎模型检验多肽体内作用,SqRT-PCR检测趋化因子及TTP的mRNA水平,探讨其作用机制．筛选到的目标多肽CI-S5趋化抑制率达到48.72%,明显抑制噬菌体阳性克隆P15与LPS激活PBMC的结合,动物试验能明显降低大鼠足肿胀及关节炎症．机制研究显示,CI-S5多肽能降低3种趋化因子的表达量,并调节TTP使其表达增加,提示CI-S5能够靶向炎症前期PBMC,为炎症治疗提供了针对早期急性炎症反应的广谱小分子抑制肽．     

利用噬菌体展示肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒模拟抗原表位

目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的模拟抗原表位。方法：用IBV阳性血清纯化IgG作为靶标。对噬菌体展示随机12肽库进行筛选，通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并对阳性克隆提取ssDNA进行测序分析。结果：3轮生物淘洗后，目标噬菌体得到125倍富集。随机挑选50个克隆进行ELISA和竞争抑制ELISA。其中有12个噬菌体克隆可以与IBV阳性血清高特异性结合。测序分析发现，这12个克隆带有2种氨基酸序列。即KSPKHSSSALHF和SFFQLNLHRPTS。且未发现这2种序列与GenBank中已发表的IBV氨基酸序列有同源性。结论：结果提示。这2个肽可能是IBV抗原的模拟表位。     

GFP质控芯片的初步研究

目的：建立一种质量控制芯片来监测样品标记、杂交和检测过程中的失误。方法：针对GFP基因设计的4条60mer寡核苷酸探针和1条阳性对照探针polv（U）与流感寡核苷酸探针一起打印在DAKO玻片上,并构建了GFP基因的克隆载体和体外表达载体,将从这两种重组载体上获得的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）基因的ILNA、DNA片段和人的全血样品中的DNA用限制性显示技术（Restriction Display technology,RD）扩增标记,将标记的样品和荧光标记的通用引物U分别与芯片杂交、检测,并对扫描的结果进行统计分析。结果：GFP探针与相应的样品杂交时出现阳性信号,阳性对照探针在所有的杂交中均出现阳性信号,而空白对照则未检测荧光信号。结论：建立的质控芯片具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片中的质量监控。     

利用荧光标记的T7噬菌体研究配体/受体的相互作用

将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)衣壳蛋白VP2展示到T7噬菌体表面,以FITC标记纯化的重组噬菌体,通过荧光显微镜观察与流式细胞仪检测,研究标记噬菌体与病毒受体细胞--法氏囊B细胞的相互作用.结果展示有IBDV VP2蛋白的噬菌体经FITC标记后仍然具有与受体细胞结合的特性,荧光显微镜下可见绿色荧光,流式数据显示其平均荧光强度明显高于阴性对照,且IBDV疫苗株TAD可明显阻断其结合.由此得出结论,FITC标记与噬菌体展示技术相结合,可进行配体/受体间相互作用的研究.     

β淀粉样蛋白人源性抗体的制备

目的:应用噬菌体展示及抗体库技术,制备并鉴定β淀粉样蛋白(Aβ)人源性抗体。方法:应用固相筛选方法,以人工合成的Aβ1-15肽为靶标分子,在大容量全合成人源性噬菌体抗体库中筛选抗Aβ人源性抗体,并进行特异性鉴定。结果:经过3轮筛选,单克隆鉴定获得噬菌体抗体F11,竞争性ELISA表明抗体对Aβ1-42的结合位点位于1～15氨基酸残基内,ELISA结果证实抗体特异性良好。结论:以Aβ1-15肽为靶标分子获得了特异性良好的人源性抗体。     

荧光定量PCR检测人巨细胞病毒的方法学建立

目的建立人巨细胞病毒（HCMV）的TaqMan MGB探针荧光定量PCR（FQ—PCR）检测方法。方法选取HCMV MIE exon4为PCR扩增靶序列,经TA克隆构建重组质粒作为定量标准品,经FQ—PCR反应条件的优化及方法学评价,再将其应用于临床检测。结果FQ—PCR最适循环参数为：95℃ 5 min;95℃ 20 s,60℃ 60 s（40 cycles）,20μl最适反应体系为：2．0mmol／L Mg^2＋、0．5μmol／L引物、1．5μmol／L探针、200μmol／L dNTP、2110×buffer、1．0 U Taq酶、2．0μl DNA模板。检测批内CV（变异系数）值为1．32％,批间CV值为1．96％;特异性较好;线性范围为10^2-10^8copies／μl。结论成功地建立了检测HCMV的FQ—PCR法,完全适用于临床检测。     

C反应蛋白在结直肠癌患者中的表达及与预后的关系

摘要目的：4g讨C反应蛋白（CRr＇）在结直肠癌患者中的表达及与预后的关系。方法：采用免疫速率散射比浊法检测血清CRP,并与健康对照组进行比较,分析CRP与临床病理分期之间的关系,评价术前、术后CRP表达与预后的关系。结果：研究组术前CRP为（28．64±7．15）mg／L,术后降低为（7．83±1．03）mg／L,差异有统计学意义（P〈0．05）,都高于对照组的（1．13±0．28）mg／L,差异有统计学意义（P〈0．05）。CRP表达与年龄和性别中的表达差异无统计学意义（P〉0．05）,与T、N、M分期和分化程度有关（P〈0．05）。术前高、低CRP组的5年生存率分别为79．17％和95．24％,差异有统计学意义（P〈0．05）;术后高、低CRP组的5年生存率分别为85．00％和88．00％,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：结直肠癌与炎症反应密切相关,CRP在其发生、发展中发挥着重要作用,术前CRP水平对疾病的预后具有一定的预测价值。     

抗RA33抗体、RF、CRP、ANA与ENA联合检测在类风湿性关节炎患者诊断、治疗及预后中的作用

目的：探讨血清抗RA33抗体、RF、CRP联合检测在类风湿性关节炎患者诊断、治疗及预后中的作用。方法：采用ELISA法对35例类风湿性关节炎患者和30例健康对照者进行抗RA33抗体的检测,间接免疫荧光法检测ANA、免疫印迹法检测ENA,免疫比浊法进行类风湿因子（RF）及CRP的检测。结果：类风湿性关节炎患者组RF水平为：[（104．51±153．88）KIU／L]与健康对照组[（10．89±2．78）KIU／L]比较,差异非常显著（p〈0．01）;类风湿性关节炎组CRP[（11．60±23．24）mg／L]与健康对照组[（2．57±2．18）mg／L]比较,差异显著（p〈0．05）;类风湿性关节炎组抗RA33抗体水平：[（17．81±35．11）U／mL]与健康对照组[（8．10±8．40）U／mL]比较,差异非常显著（p〈0．01）。RF、抗RA33抗体、CRP及ANA诊断类风湿性关节炎的灵敏度分别为：80．00％,34．29％,42．86％,62．86％;RF、抗RA33抗体、CRP及ANA诊断类风湿性关节炎的特异性分别为：93.33％,93.33％,90．00％,96．67％;ENA的检出率均较低。结论：类风湿性关节炎患者抗RA33抗体检出的灵敏度低,但特异性强。对类风湿性关节炎患者进行抗RA33抗体、ANA、RF、CRP、ENA联合检测,对于疾病的进展、病因分析、指导治疗和改善预后均具有重要意义。     

临床皮炎外瓶霉荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立基于TaqMan探针技术的皮炎外瓶霉荧光定量PCR检测方法.方法 通过对皮炎外瓶霉ITS区域基因组序列（GenBank：JN675373.1）进行分析,设计合成特异性引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR反应条件.以临床标本中分离的皮炎外瓶霉为阳性菌株,及其他种类真菌和细菌作为阴性对照菌株,从特异性、敏感性及重复性方面对该方法检测效果进行评价.结果 该研究设计的引物和探针能扩增皮炎外瓶霉特异性序列.临床分离得到的皮炎外瓶霉在反应中有明显扩增曲线,而甄氏外瓶霉、棘状外瓶霉、烟曲霉、白色念珠菌、新生隐球菌、马内菲青霉等20株菌在CT值≤38范围内均未有扩增;利用基因重组构建的标准品完成了标准曲线的绘制,在1.0×103～1.0×107拷贝数（Cp）内具有良好的线性关系（R2=1.000）,最低可检出量为10 Cp/μL.结论 成功建立了荧光定量PCR检测皮炎外瓶霉方法,该法特异度强、敏感度高、重复性好,将有助于临床皮炎外瓶霉感染的早期诊断和针对性治疗.     

超声波提取加拿大蓬总黄酮的研究

目的:研究加拿大蓬中总黄酮提取方法及最佳工艺.方法:采用超声提取法,通过单因素试验和正交试验筛选最佳工艺条件.结果:最佳提取条件为60%乙醇、料液比1:20、60 kW下超声45 min.得率为31.076 mg/g.结论:该方法提取提取总黄酮快速、简便,可适用于生产中加拿大蓬总黄酮类物质的检测.该方法是提取加拿大蓬总...     

一种体内标记转录RNA的新技术

目的:验证一种体内标记转录RNA的新技术,并用该技术观察一种长寿药物雷帕霉素对真核细胞HEK293中RNA合成的影响。方法:将尿嘧啶类似物5-乙炔尿苷(EU)和雷帕霉素加到HEK293细胞培养基中,共同孵育2h,然后在激光共聚焦显微镜下对EU标记的新合成RNA进行观察;用Image-pro plus软件对图像的荧光强度进行分析,获得反应荧光强度的平均光密度数值;用SPSS软件对数值进行统计分析。结果:激光共聚焦显微镜下,可见EU标记的新合成RNA主要分布在胞质和核仁中,以核仁中荧光最强;Image-pro plus软件和SPSS软件分析表明,加入雷帕霉素前后,细胞新合成的RNA平均光密度无明显差别。结论:EU是一种安全、简单、快速而灵敏的检测新合成RNA的新技术,用该技术检测表明长寿药物雷帕霉素不影响真核细胞HEK293中总RNA的合成。     

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157:H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157:H7核酸的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108cfu/mL。稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06%和2.45%。     

血清降钙素原在鉴别细菌性感染与自身免疫性疾病活动期中的应用价值

目的：探讨血清降钙素原（procalcitonin,PCT）在鉴别诊断自身免疫性疾病活动期与细菌感染中的应用价值。方法：选择析深圳市保健办2011年1月-2012年3月收治的30例自身免疫性疾病活动期和34例细菌感染患者为研究对象,测定其血清c反应蛋白（C-reactive protein,CRP）和PCT的水平。结果：感染组患者CRP水平为（0．1162±0．0873）gm,PCT水平（2．37±7．02）±10^-3gm,自身免疫活动期患者CRP水平（0．0639±0．0687）gm,PCT浓度（0．09±0．08）×10^-3g／L。ROC曲线下面积（AUC）和95％可信区间（CI）分别为0．75和0186,0．61-0．83和0．74-0．94,差异具有统计学意义（P〈0．05）。CRP联合PCT水平预测的AUC为0．82．其与单独PCT水平相比没有显著性差别（P=0．74）。CRP的最佳临界值为0．0722g／L,灵敏度为73．5％,特异性为69．2％;PCT的最佳临界值为0．09×10^-3g/L,其灵敏度为82．1％,特异性为72．5％。结论：在鉴别活动期自身免疫疾病患者与细菌感染时,PCT的灵敏度与特异性比CRP高,但其联合CRP对此类诊断并无显著意义。     

用反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌

目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25～30 mer探针加长到30～38 mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100 fg DNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。