Arthrobacter K1108乙内酰脲酶反应条件和立体选择性研究

研究了Arthrobacter K1108乙内酰脲酶的反应条件,结果表明,K1108乙内酰脲酶的最适反应温度为55℃,最适pH为7.0,Co^2 和Fe^2 对该酶有激活作用,而Ca^2 有严重抑制作用。K1108乙内酰脲酶的底物专一性较强,其最适底物为5－苄基乙内酰脲,5－苯基乙内酰脲和5－吲哚甲基乙内酰脲均不能作为其有效底物。对K1108乙内酰脲酶立体反应机制研究结果表明,其乙内酰脲水解酶不具立体选择性,决定产物立体构型的酶是N－氨甲酰氨基酸水解酶。     

木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质

研究了木霉GXC产 β 葡聚糖酶的条件。结果表明 ,最适产酶碳源为麸皮 ,氮源为硫酸铵 ;产酶的最适条件为 :初始pH为 4 0～ 5 0 ,30℃培养 44h。粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG 2 5、SephadexG 1 0 0和DEAE SephadexA 50柱层析得到纯β 葡聚糖酶 ,SDS PAGE凝胶电泳显示一条带 ,测得分子量为 35kD。该酶最适反应pH5 0 ,最适反应温度为 60℃ ,在 40℃以下、pH4 0～ 5 0酶活力相对稳定。 5 0mmol L以下的Ca²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺,以及 1 0 0mmol L以下的Co²⁺对酶活力有激活作用 ;而Cu²⁺和Fe³⁺具有抑制作用。     

节杆菌K1108乙内酰脲酶产酶条件研究

研究了乙内酰脲酶产生菌节杆菌K1108的产酶条件。该菌乙内酰脲酶为诱导酶,存在于细胞内,乙内酰脲水解酶和N氨甲酰氨基酸水解酶是同时被诱导产生。最适诱导物为5苄基乙内酰脲,而5吲哚甲基乙内酰脲和5苯基乙内酰脲等不能诱导其酶的产生。筛选到一种安慰诱导物,诱导活性提高了2倍多。对产酶培养基进行了筛选和优化,在最适条件下,K1108产酶能力可达108U/mL。     

日本根霉IFO5318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe³⁺、Hg²⁺等对酶活力有抑制作用。     

乳酸克鲁维酵母β－半乳糖苷酶的分离纯化及性质研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)经高压破壁后的粗提液,其β-半乳糖苷酶(E．C．3．2．1．23)比活力为5．56u／mg。经硫酸铵沉淀,丙酮沉淀,PAPMA—Sepharose 4B柱层析后,乳糖酶比活力达370u／mg,纯化了66．2倍,SDS—PAGE鉴定为一条带,分子量85000Da。酶作用的最适pH在6．4—6．8之间,最适温度40℃,50℃保温15min酶活丧失90％。以邻硝基苯一β一半乳糖苷(ONPG)为底物的米氏常数为2．78mmoI／L。酶的正常水解产物半乳糖对酶活力有一定的抑制作用,核糖强烈抑制酶活力,Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、PCMB和NBS都能使酶活丧失。Mg²⁺、Mn²⁺和还原剂巯基乙醇的存在能提高酶活力。     

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 pH分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β-     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A236热稳足葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A2a6在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、Sephacryl S100凝胶过滤和FPLC Mono Q离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶(EC 3．2．1.3)。SDS-PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,pI为4．0,富含val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温lh,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min, Ca²⁺对酶有激活作用,Fe³⁺、Al³⁺、Hg²⁺等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉,直链淀粉、支链淀粉．糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

豆乳凝固酶产生菌UV-10发酵条件及其酶学性质的研究

豆乳凝固酶产生菌Bacillussp .UV 1 0的最适产酶条件 :初始pH6 4,温度 2 6℃ ,培养时间 1 9h ,需要较大的通气量。酶的最适作用pH和温度分别为 5 8和 70℃。在最适条件下酶活力可达 1 84u/mL。pH6 0～ 7 0稳定性较好。 6 0℃下 1h残余酶活 6 0 %。Ca²⁺,Fe²⁺,Mg²⁺,Na⁺对其有较强的激活作用 ,而Zn²⁺,Al相似文献   

Sinorhizobium morelensS-5中N_氨甲酰基水解酶基因的克隆、表达和纯化

N_氨甲酰基水解酶是一种非常具有工业应用价值的水解酶,可用于制备光学纯氨基酸。通过LA PCR 从 Sinorhizobium morelens S_5 菌中克隆到13kb的DNA片段,测序表明该片段上含有一个完整的N_氨甲酰基水解酶的基因（hyuC）序列。将hyuC基因克隆到表达载体pET30a上,重组质粒pET30a_HyuC在大肠杆菌中获得了高水平表达。重组的N_氨甲酰基水解酶经过热处理和三步柱色谱分离而纯化。纯化倍数为16.1倍,收率21.2%。该酶为同源四聚体,亚基分子量是38kDa。最适温度是60℃,最适pH为7.0。该酶有较高的热稳定性和氧化稳定性。Fe²⁺和Ca²⁺对酶的活性有一定的促进作用,而金属螯合剂和巯基试剂对酶活无明显影响。     

绮丽刺毛霉的一种新型甘氨酸氨肽酶的研究

研究了产自于绮丽刺毛霉（Actinomucor elegans）的一种甘氨酸氨肽酶。分子筛层析表明该酶的天然分子的分子量为320kD,SDSPAGE分析表明蛋白质的亚基分子量为565kD。该酶水解含有甘氨酸残基的底物（如glycinenaphthylamine）的效率要较其它氨基酸残基高得多。该酶的最佳反应温度为30℃,最佳pH为8.0。酶的Km和Kcat值分别为0.24mmol/L与1008 s^-1。1.0mmol/L Zn²⁺,Cu²⁺和Cd²⁺可完全抑制该酶的活性。作用于酶巯基的化学物质对酶活性都有抑制作用。根据络合剂反应的实验结果表明该酶是一种含有金属的酶。当与蛋白酶共同作用时该酶除了甘氨酸外还能提高脯氨酸、精氨酸及谷氨酸的水解率。     

黑曲霉菊糖酶的纯化及性质

黑曲霉(Aspergillus niger)319发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素52离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析,得到了电泳纯的菊糖酶组分。提纯倍数为67,收率为25.5％。菊糖酶的最适pH为5.0,最适温度为60℃。此酶为单亚基蛋白,凝胶过滤法测得分子量为28000,含糖13.9％,用等电聚焦法测得等电点为5.4,该酶对温度有较高的稳定性,对pH的稳定范围较窄。Hg²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对该酶有强烈的抑制作用。此酶对菊糖有较强的底物专一性,产物为果糖,但它也可作用于蔗糖,I/S值为0.348。当以菊糖为底物时,K_m为6.25mmol/L,V_m为67.11 μmol·mg~(-1)·min~(-1)。     

球孢白僵菌胞内几丁质酶的分离纯化及性质

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)突变株CH-1316细胞裂解液经(NH_4)_2SO_4沉淀,DEAE-纤维素层析及凝胶过滤,分离出一种几丁质酶,该酶的分子量为32000;最适pH为5.0;最适温度为40℃;最适离子强度为0.2mol/L NaCl;Hg²⁺、Fe²⁺是该酶的强抑制剂;该几丁质酶完全不水解纯的片状几丁质,脱矿几丁质也不是该酶的良好底物;该几丁质酶水解几丁寡糖,但不水解几丁二糖;对几丁五糖以上的寡糖水解速度较快,而对几丁三糖和四糖水解速度则慢得多。     

担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析、Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow疏水柱层析等方法,得到电泳纯的漆酶同工酶Lac1,纯化倍数为318.4,活力回收率为18.6％。用SDSPAGE测得该酶分子量为60.3kD,而经质谱分析为55.94kD。最适反应温度为65℃,最适反应pH值为2.2～2.8,酶的等电点pI（室温）为4.02,其N末端序列为AIGPVTDL,用硫酸酚法测得其含糖量为49.2％。25℃条件下,以ABTS(2,2'azinobis(3ethylbenzthiazoline6sulphonate)为底物的Km为17.5μmol/L。该酶在45℃,pH3.0～9.5较稳定。Cu^2＋对酶活有明显的促进作用,Fe^2＋完全抑制酶的活性,Mn^2＋和Ag^＋对酶活无明显影响。DTT（Dithiothreitol,二硫苏糖醇）和NaN3完全抑制酶的活性。Koshland试剂对漆酶的活力影响比较大,色氨酸可能是酶活力的必需基团。     

蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究

研究了蜜环菌胞外漆酶合成条件和酶学性质。实验表明,培养基初始pH5.5、培养温度25℃有利于菌株产酶;与麦芽糖、山梨糖和半乳糖相比,纤维二糖和棉子糖作为碳源时漆酶产量更高;有机氮源比无机氮源有利于漆酶合成。泥炭提取液可显著诱导漆酶生成,当其含量为50%时,菌株漆酶最高产量是对照组的7倍。在蜜环菌发酵上清液中检测到3个漆酶同功酶组分,其主要活性（约占75%）组份漆酶A经 (NH₄)₂SO₄沉淀、制备级PAGE电泳和阴离子交换柱层析被分离纯化至电泳均一,SDSPAGE法测得酶亚基分子量59kD,凝胶过滤色谱法测定活性酶分子量58kD。纯化的漆酶A等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为5.6,最适温度为60℃,在60℃和65℃时半衰期分别为45min和36.8min,在pH5.2～7.2范围内稳定性较好。100mmol/L Cl^-对该酶有显著抑制作用,1mmol/L SO^2-₄ 对漆酶有激活作用,1mmol/L NaN₃可完全抑制酶活性,10 mmol/L EDTA对漆酶活没有明显影响,1mmol/L Cu²⁺对漆酶有激活作用。以愈创木酚为底物时,测得酶的K_m=1.026mmol/L,V_max=5μmol/(min·mg);以ABTS为底物时,测得其K_m=0.22mmol/L,V_max=69μmol/(min·mg)。     

甲基对硫磷水解酶参与催化相关结构的研究

甲基对硫磷水解酶（MPH）是一种新的有机磷水解酶。将完整的甲基对硫磷水解酶基因（mpd）构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在Escherichia coli DH5α中表达并得到了纯化。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂1, 10菲NFDA1啉的影响;但用电感耦合等离子发射光谱测定其金属含量显示MPH是金属酶,1mol酶中结合了2mol的Zn²⁺。为确定参与MPH催化活性的必需氨基酸,用化学修饰剂碳化二亚胺、二乙基焦磷酸酯、磷酸吡哆醛和丁二酮处理MPH,然后检测其残余酶活力,结果表明天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与酶的催化活性无关;而二乙基焦磷酸酯对组氨酸侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度的下降,其对酶活性的抑制率达到9.6h^-1,说明组氨酸是酶活力所必需的基团。这些结果为进一步研究酶的结构及对酶进行分子改造提供了必要的基础数据。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的提纯及性质研究

目的:研究兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的分离纯化方法及其酶学性质,为测定血清甘油三酯所用酶联试剂的开发提供试验基础和理论依据。方法:通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、Blue-Sepharose和羟磷灰石纯化兔肌3-磷酸甘油脱氢酶,利用凝胶过滤和梯度PAGE(5%～15%)法测定酶分子量,采用常规酶学动力学分析方法,考察pH、温度、底物浓度以及部分金属离子与有机化合物对酶促反应的影响。结果 纯化后的兔肌3-磷酸甘油脱氢酶经PAGE(12%)分析为单一条带;酶分子量为115～122 kDa;酶最适温度45℃,最适pH 9;酸碱稳定范围pH6～9,低于45℃时热稳定性好;最适条件下,以3-磷酸甘油和NAD⁺为底物,测得酶的K_m分别为7.4×10^-3mol/L和1.47×10^-4mol/L;Ba²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Ag⁺、Hg²⁺、NaN₃、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Zn²⁺有一定程度的激活作用,其中Co²⁺和Zn²⁺对酶的激活作用能达到200%以上,有机化合物NaF对酶的活性没有影响。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

固定化尖镰孢菌细胞的某些酶学特性

尖镰孢菌(Fusariun oxysporum)33—11是一株青霉素V酰化酶的高产菌株。用二醋酸纤维素固定的该菌细胞裂解青霉素V最适的Ph范围为7．4至7.6;最适的反应温度为45℃至48℃;其酶活性受8-羟基喹啉和EDTA的可逆抑制,Mg²⁺、Zn^2-和Mn^2-离子则有激活作用。采用问歇式搅拌裂解青霉素V,测得0．6rnm颗粒度固定化细胞的表观km值为11．7mmol／L。裂解青霉素V的反应活化能为33kJ／mol;底物抑制常数Ks为1950mmol/L;苯氧乙酸和6-APA的抑制常数分别为220mmol／L和270mm0I／L,在裂解反应中．前者是竞争性抑制剂,后者是非竞争性抑制剂。     

白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质

DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50三步柱层析分离法,从白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒中分离纯化出具有5′-核苷酸酶活性的组分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为48.03 kDa,HPLC柱层析图谱为单一峰。该组分是一个糖蛋白,以一磷酸腺苷（AMP）为底物时,其酶活力为330.33 μg Pi/（min·mg）;而以二磷酸腺苷（ADP）为底物时,其酶活力为123.56 μg Pi/（min·mg）。金属离子Zn²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对5′-核苷酸酶活性有显著的抑制作用,EDTA可完全抑制其酶活性。该酶的最适pH为9,最适温度为50℃。该组分还具有抑制由ADP诱导的血小板聚集的生物功能。