饲料中维生素和无机盐对rBmNPV-Bm表达系统植酸酶基因表达活性的影响

【目的】为查明宿主的营养对重组家蚕杆状病毒-家蚕表达系统(rBmNPV-Bm)外源基因表达活性的影响,探寻提高家蚕Bombyx mori生物反应器产率的新途径。【方法】以家蚕BmNPV病毒为表达载体,以人工饲料饲养的5龄家蚕为宿主,以植酸酶基因为报告基因,探讨了家蚕人工饲料中维生素和无机盐对外源基因表达产物活性的影响。【结果】家蚕血淋巴中外源植酸酶的活性随着饲料中维生素和无机盐添加量的不同而发生显著变化。在本试验设区范围内,当维生素C的含量为饲料干物质量的1 %,B族维生素混合物为0.25 %,无机盐混合物为1 %,维生素B6为100 g饲料干物中含2 mg时,血淋巴中植酸酶活性达到最大值。【结论】通过改变家蚕饲料中微量营养成分的含量是提高rBmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的有效途径。     

昆虫保幼激素促进家蚕杆状病毒系统的基因表达

杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression VecterSvstem,BEVS)的一个最大优点是外源基因的高效表达(Hy-perexpression).但是,不同的外源基因在BEVS系统中的表达水平相差很大,较低的如α-干扰素,表达量为1～5mg/L培养细胞;高的如β-半乳糖苷酶,表达量可达600mg/L培养细胞.外源基因在BEVS系统中表达量受到诸多因素的影响,如细胞的类型与质量,外源基因蛋白的性质,启动子序列的完整性,是否为融合蛋白等[1].如何使外源基因在BEVS系统中高效表达,是近年来该领域中研究最活跃的方向之一.已证实家蚕杆状病毒的表达量受宿主遗传型的影响,最低和最高的遗传型相差达7倍以上[2].林水中等发现家蚕饲料中添食适当浓度的硫酸铜可提高外源基因单位表达量10%左右[3].杆状病毒在复制循环中表现出两种类型:芽生病毒和包涵体病毒,其中芽生病毒引起宿主体内不同组织间的感染,包涵体病毒则引起宿主之间感染[1].杆状病毒基因组中蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(egt)基因影响激素在宿主体内的平衡[4],egt基因通过糖基化作用使蜕皮激素失活,打破宿主体内的激素平衡,延长幼虫期,以利于病毒的增殖[5].家蚕血淋巴中保幼激素(Juvenile hormone,JH)的滴度同样决定着幼虫发育的进程[6],本文通过体表使用保幼激素,以研究保幼激素对家蚕核型多角体病毒和宿主之间的相互关系及对外源基因表达量的影响.     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。     

东方蜜蜂微孢子虫感染对中华蜜蜂免疫基因表达和血淋巴中糖水平的影响

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae主要感染蜜蜂的消化系统,它被认为是引起蜂群崩溃综合症(Colony collapse disorder,CCD)的主要原因之一。东方蜜蜂微孢子虫对新寄主西方蜜蜂Apis mellifera的影响已得到广泛的研究,但它对原宿主中华蜜蜂Apis cerana cerana影响的报到则相对较少。本实验以意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica来源的东方蜜蜂微孢子虫感染中华蜜蜂,分析感病中华蜜蜂的免疫基因表达和血淋巴中糖含量变化,评价东方蜜蜂微孢子虫对中华蜜蜂健康的影响。【方法】利用荧光定量检测样本的免疫基因(vitellogenin、abaecin、apidaecin、hymenoptaecin、defensinl、defensin2和eater)表达量,分析东方蜜蜂微孢子虫的感染能否引起中华蜜蜂免疫应答。通过高效液相色谱法对样本的血淋巴进行糖浓度定量分析,检测其血淋巴中葡萄糖、海藻糖含量。【结果】所研究基因中,hymenoptaecin基因表达量在14日龄时感染组和对照组差异显著、vitellogenin基因表达量在7日龄时感染组和对照组间差异显著、defensin2基因表达量在7日龄和14日龄时感染组和对照组均差异显著,其他基因的表达量在均未达到显著水平;血淋巴中的葡萄糖与海藻糖的浓度在处理组和对照组间差异不显著。【结论】东方蜜蜂微孢子虫侵染中华蜜蜂后,hymenoptaecin、vitellogenin,defensin2基因在相应的日龄可对病原物应答,然而血淋巴中的葡萄糖和海藻糖的浓度不因侵染与否变化。     

寄主植物对甜菜夜蛾感染核型多角体病毒后黑化反应关键酶活性的影响

【目的】明确寄主植物对感染核型多角体病毒的甜菜夜蛾Spodostera exigua (Hübner)幼虫体内参与黑化反应的关键酶的影响。【方法】借助紫外分光光度计或酶标仪,测定了取食不同食物(蕹菜、甘蓝、黄豆和人工饲料)的感毒与未感毒甜菜夜蛾幼虫血淋巴中多酚氧化酶、酪氨酸羟化酶和多巴脱羧酶含量。【结果】两因素分析显示,感毒和食物两个因子及其交互作用显著影响幼虫血淋巴中这3种酶的活性;进一步比较发现,取食蕹菜的感毒幼虫多酚氧化酶活性最高,取食甘蓝的次之,而以黄豆和人工饲料为食物的多酚氧化酶活性最低,感毒幼虫血淋巴中其他两种酶活性也表现相同的趋势。【结论】寄主植物能够调控感毒甜菜夜蛾幼虫体内参与黑化反应的关键酶活性,而这些关键酶活性的变化可能与寄主植物调控甜菜夜蛾对核型多角体病毒的敏感性有关。     

饥饿胁迫下家蚕5龄起蚕中的蛋白表达谱及 BmLp-c 6的转录分析

【目的】分析家蚕Bombyx mori受饥饿胁迫后的蛋白质谱变化,探索其耐受饥饿的机理。【方法】以家蚕品种932为实验材料,利用双向电泳和质谱技术检测5龄起蚕经过24 h饥饿胁迫的蛋白质谱差异变化,利用荧光定量PCR技术分析BmLp-c 6的转录表达。【结果】经比对饥饿蚕和正常取食蚕的血淋巴蛋白谱,饥饿蚕有62个特异蛋白点。蛋白点的等电点在4.22~6.98之间,分子量分布在20.81～144.69 kDa间。选取只在饥饿时出现的特异蛋白点No. 7111进行质谱鉴定,根据其氨基酸序列进行引物设计,获得了目的基因BmLp-c 6,经与载体pET-21d(+)连接重组后,成功获得诱导表达。经实时荧光定量PCR分析,当5龄起蚕受到饥饿胁迫影响时,BmLp-c 6基因在血淋巴中大量转录表达,但在中肠中的转录表达水平却极低。【结论】家蚕5龄起蚕在饥饿胁迫下,血淋巴中的蛋白质谱发生变化,BmLp-c 6会大量转录表达。     

淡足侧沟茧蜂寄生对草地贪夜蛾幼虫血淋巴黑化反应及酚氧化酶的影响

【目的】明确淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes寄生对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda血淋巴黑化率、酚氧化酶原（Prophenoloxidase,PPO）基因表达量和酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）活性的影响,为更有效的利用淡足侧沟茧蜂防控草地贪夜蛾提供理论依据。【方法】通过室内寄生实验确定草地贪夜蛾被淡足侧沟茧蜂寄生的最佳龄期;通过RT-qPCR分析草地贪夜蛾两个PPO基因（SfPPO1和SfPPO2）的时空表达谱;通过薄膜法统计草地贪夜蛾被寄生后的血淋巴黑化率;采用吸光光度法测定草地贪夜蛾被寄生后的血淋巴PO活性;采用RT-qPCR测定草地贪夜蛾被寄生后血淋巴SfPPO1和SfPPO2的相对基因表达量。【结果】草地贪夜蛾被淡足侧沟茧蜂寄生的最佳龄期为3龄幼虫,SfPPO1和SfPPO2均在卵块和4龄幼虫中基因表达量较高,且主要在幼虫血淋巴中表达。草地贪夜蛾被寄生后12、24、48和72 h的血淋巴黑化率显著低于未寄生组（P<0.05）,SfPPO1和SfPPO2的相对基因表达量和PO活性也低于未寄生组。相关关系分析表明,SfPPO1的相对基因表达量与SfPPO2的表达量呈现线性关系（R2=0.9124）,PO活性与两个PPO基因相对表达量之间、黑化率与PO活性和PPO基因相对表达量之间均呈现正相关。【结论】淡足侧沟茧蜂寄生会抑制草地贪夜蛾血淋巴的黑化率,下调血淋巴中酚氧化酶原基因的表达量和PO活性,且PO活性、PPO基因相对表达量及血淋巴黑化率3个指标之中,两两之间均呈现正相关性。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART, 多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号: XM_038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域,而与β-catenin结合的N末端CTNNB1结构域部分氨基酸残基发生变异。组织表达谱显示,Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫中肠、血淋巴和性腺中的相对表达水平较高,在头、体壁、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管中的相对表达水平较低。【结论】本研究克隆了家蚕Pangolin X3,分析了其序列和表达特征,为深入研究家蚕Pangolin的生物学功能提供了基础。     

桃蛀螟CYP6AE76基因参与对Cry1Ab蛋白的解毒作用

【目的】明确桃蛀螟Conogethes punctiferalis幼虫取食Cry1Ab蛋白后体内CYP6AE76的过表达及对Cry1Ab蛋白有解毒作用。【方法】分析桃蛀螟CYP6AE76序列特征;利用RT-qPCR检测CYP6AE76在不同发育阶段(1-5龄幼虫)和4龄幼虫不同组织(头、中肠、血淋巴和脂肪体)以及4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(LC₅₀=1.08 ng/cm2)的人工饲料3 d存活的幼虫中肠和血淋巴中的表达量;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟4 龄幼虫CYP6AE76后检测中肠中CYP6AE76的表达量,并统计120 h后幼虫体重并计算幼虫存活率;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟初孵幼虫CYP6AE76后饲喂含1.08 ng/cm² Cry1Ab蛋白的饲料,7 d后统计幼虫体重并计算幼虫存活率。【结果】桃蛀螟CYP6AE76基因开放阅读框长1 572 bp,编码524个氨基酸,分子量约为60.34 kD,属于CYP6家族基因。发育表达谱结果表明, CYP6AE76基因在桃蛀螟整个幼虫阶段均有表达且在1龄幼虫期表达量最高,随着幼虫龄期增大而表达量降低;组织表达谱结果表明,CYP6AE76在4龄幼虫中肠中表达量最高。4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(1.08 ng/cm²)的人工饲料后,CYP6AE76在中肠和血淋巴中的表达量相比对照显著上调。通过RNAi沉默CYP6AE76后,桃蛀螟初孵幼虫再取食含有Cry1Ab蛋白的人工饲料后体重显著降低。【结论】CYP6AE76可能参与对桃蛀螟幼虫摄入的Cry1Ab蛋白的解毒。     

家蚕miR-2769靶基因的鉴定及表达分析

【目的】MiRNAs在昆虫变态发育过程中发挥非常重要的作用。对家蚕Bombyx mori miRNAs及靶基因的研究将有助于阐明miRNAs参与调控家蚕变态发育的分子机制。【方法】往家蚕5龄第2天幼虫血淋巴注射蜕皮激素20E后,qRT-PCR检测miR-2769在家蚕脂肪体中的表达;通过生物信息学方法预测家蚕miR-2769的靶基因;利用双荧光酶报告载体系统分析miR-2769与预测靶基因BmE75B的互作;qRT-PCR检测miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接体在家蚕不同发育时期(幼虫、蛹和成虫)和幼虫不同组织(头、表皮、丝腺、脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、中肠和血淋巴)中的表达量。【结果】研究结果表明,miR-2769可通过与家蚕BmE75B的3′UTR区结合位点的互作,显著抑制荧光素酶报告基因的表达。qRT-PCR结果表明,miR-2769和BmE75A/BmE75B在20E诱导家蚕脂肪体中表达趋势相反。时空表达分析结果表明,miR-2769与BmE75的不同剪接体在家蚕不同发育时期和不同组织中均具有特异性表达特征。在家蚕变态发育的不同阶段,miR-2769和BmE75A的表达量均较低,而BmE75B在蛹期表达量较高,BmE75C在5龄末幼虫和蛹早期有极高表达水平。此外,miR-2769与BmE75不同剪接体均存在一定程度的表达负相关。在家蚕5龄幼虫血淋巴中miR-2769可促进BmE75A的表达,在脂肪体中miR-2769可促进BmE75B的表达,而在其他组织中miR-2769抑制BmE75不同剪接体的表达。【结论】家蚕miR-2769可通过与BmE75B的3′UTR区的互作对BmE75不同剪接体的表达进行负调控。     

家蚕非编码RNA在神经系统中的表达分析

【目的】非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在家蚕Bombyx mori发育过程中具有重要调控作用。本研究旨在探索ncRNA参与家蚕神经系统发育的分子机理。【方法】采用实时荧光定量PCR技术对22个中等长度的ncRNA及3个ncRNA的邻近编码基因在家蚕幼虫神经系统中的表达水平进行检测。【结果】8个ncRNA(包括1个C/D box snoRNA,4个H/ACA box snoRNA和3个不能归类的ncRNA)在家蚕5龄幼虫神经组织和非神经组织中均有表达,且在胸腹神经中的表达量明显高于头部神经中的表达量。其中,snoRNA Bm-51,Bm-18和Bm-86在胸腹神经中的表达量分别是头部神经中的23,5和4.7倍。进一步研究发现,这3个内含子起源的ncRNA与其宿主基因在家蚕神经系统中的表达趋势一致,宿主基因在胸腹神经中的表达量也明显高于头部神经中的表达量。【结论】本研究筛选到的在家蚕不同神经部位存在差异表达的ncRNA,特别是在胸腹神经中高表达的ncRNA可能协同其邻近编码基因,参与家蚕神经发育或神经活动过程。该结果为研究ncRNA参与家蚕神经系统发育提供了分子依据,为从非编码RNA角度探索鳞翅目害虫防治提供了新的思路。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶基因的表达谱分析

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine- 5′-phosphate oxidase, PNPO）基因在家蚕不同发育阶段及5龄幼虫不同组织中的表达差异。【方法】将家蚕PNPO基因的重组表达质粒pET-22b(+)-PNPO转化入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达, 纯化蛋白制备多克隆抗体。分别采用荧光定量PCR和Western blot方法对家蚕PNPO基因进行了转录水平和翻译水平的表达分析。【结果】在家蚕发育水平上, 5龄幼虫的PNPO翻译量为最高。PNPO基因在5龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为精巢、 头、 中肠、 马氏管、 卵巢、 表皮、 脂肪体、 丝腺; 翻译量也以精巢为最高, 其次是头、 中肠和马氏管。【结论】明确了PNPO在家蚕各发育阶段及5龄幼虫各组织中的表达情况。     

造血器官机能障碍后家蚕血淋巴中蛋白质成分的变化

为了研究家蚕Bombyx mori造血器官机能障碍后其血淋巴中蛋白质成分的变化,利用重离子射线局部照射家蚕幼虫的造血器官,检测了照射后家蚕血淋巴中的蛋白质成分及注射大肠杆菌后在体内诱导出现的应急蛋白量的变化。结果表明,照射蚕血淋巴中的蛋白质含量与对照蚕之间没有明显的差异。但在成分分析时发现,5龄起蚕血淋巴中70 kD附近的3条蛋白质谱带比对照蚕的浓度要高,随着个体的发育两者的浓度都上升;5龄后期则相反,对照蚕的浓度比照射蚕高;脂肪体中贮藏蛋白质的含量具有相似的变化趋势。用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清进行免疫印迹反应的结果显示：70 kD附近的3条蛋白质谱带的最上面的一条为贮藏蛋白质SP-1,下面的二条为贮藏蛋白质SP-2;同时照射蚕血淋巴中分子量约为24 kD的蛋白质成分也发生变化,5龄前期的浓度比对照蚕低,5龄第3天几乎检测不到;全体照射与造血器官局部照射蚕之间的结果相似。照射蚕注射大肠杆菌后在体内诱导出现的应急蛋白量明显比对照蚕要少。由此认为家蚕幼虫造血器官与血淋巴中的蛋白质成分有关,造血器官的机能障碍、血球的数量减少可影响脂肪体中蛋白质的合成,从而使存在于血淋巴中的蛋白质成分发生变化。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂20的表达特征分析

【目的】原核表达家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂20(Serine proteinase inhibitor 20,Bm Serpin-20),分析Bm Serpin-20基因和蛋白组织表达分布特点,以及不同外源病原物刺激家蚕后Bm Serpin-20基因的表达模式。【方法】利用p ET-28a表达载体在大肠杆菌Transetta(DE3)中融合表达Bm Serpin-20蛋白,利用纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用实时定量PCR技术及Western blot方法分别分析Bm Serpin-20基因和蛋白的组织表达水平,以及病原物免疫刺激后的表达模式。【结果】在大肠杆菌中正确表达和纯化了融合Bm Serpin-20蛋白,并制备了多克隆抗体;Bm Serpin-20基因和蛋白在脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、表皮、睾丸、卵巢中均有表达,且在表皮中表达量最高;家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis viruses)、藤黄微球菌Micrococcus luteus、大肠杆菌Escherichia coli、白僵菌Beauveria bassiana处理后,Bm Serpin-20基因表达量先下调而后上调,但不同病原物在不同时间的影响不尽相同。【结论】研究了Bm Serpin-20基因和蛋白的表达模式,为下一步研究其在家蚕免疫系统中的作用奠定了基础。     

镉胁迫对家蚕脂肪体脂质过氧化物含量及抗氧化酶活性和mRNA表达的影响

【目的】探讨鳞翅目模式昆虫家蚕Bombyx mori作为重金属污染的监测指示生物在镉胁迫下的酶反应及相关的基因表达。【方法】给家蚕幼虫期全龄添食镉(Cd²⁺), 调查不同性别家蚕5龄幼虫脂肪体中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量, 超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性及其基因表达水平的变化。【结果】Cd²⁺胁迫对雌雄家蚕MDA 含量均具有浓度效应关系, MDA含量随Cd²⁺胁迫浓度的升高而增加。Cd²⁺胁迫下, SOD和CAT活性表现为先升后降的变化趋势, Pearson相关性分析显示SOD和CAT活性变化有显著相关性(雄: R=0.770, P=0.001; 雌: R=0.854, P=0.000）。雌性家蚕脂肪体中CAT活性变化和Cat mRNA水平的表达具有正相关性（R=0.712, P=0.003）。雄性家蚕脂肪体中GSH-Px活性随Cd²⁺胁迫浓度的升高而增加, 显示浓度 效应关系, 12.5~50 mg/kg Cd²⁺胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著差异（P<0.05）, 其活性和GSH-Px mRNA水平的表达具有正相关性（R=0.834, P=0.000）; 雌性家蚕脂肪体中GSH-Px活性表现为先升后降的变化趋势, 12.5 mg/kg Cd²⁺胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著增加（P<0.01）。【结论】结果表明, 急性镉胁迫对家蚕脂肪体有明显的毒性作用, 其作用机制与脂质过氧化加剧和抗氧化酶活性变化有关。家蚕对重金属镉的解毒机制有性别相关性。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6的克隆、序列分析和组织表达

本文利用RT-PCR和RACE方法,获得了家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（serpin）的开放读码框(ORF) 和5′UTR序列。根据该基因与其他昆虫serpin的同源性关系将其命名为家蚕serpin-6 基因,GenBank登录号EU159447。为了研究serpin-6与家蚕免疫反应的相关机理,对serpin-6基因的组织表达和免疫刺激反应进行了研究。结果表明该基因在家蚕的头部和生殖腺中mRNA表达量非常高,在中肠,脂肪体,丝腺和血淋巴表达量较低。用脂多糖(LPS) 刺激5龄第3 d家蚕后,serpin-6基因在脂肪体和血淋巴中都被显著诱导表达,且都在刺激6 h后表达量最高。推测该基因在家蚕细胞免疫反应中起着一定的作用。     

信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

乙醇氧化酶启动子被分离、克隆 ,并建立了转化方法后 ,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达 ,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I,随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入 1～ 10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸 ,构成 10种不同的分泌信号肽序列 ,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加 ,而以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大 ;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比 ,使植酸酶分泌表达量增加 5倍 ,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为 90mg/L。此外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了EEAEAEAEP和K共 10个氨基酸 ,进一步提高信号肽的分泌效率 ,使表达又提高约 35 % ,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到 12 0mg/L ,是pPCI9K表达量的 8倍。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。