家蚕bHLH转录因子Bmsage可溶性表达、纯化与结构分析

碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子在生命活动过程中发挥着重要的调控作用。Bmsage是家蚕丝腺中高量表达的一类bHLH转录因子,不仅参与了丝腺细胞在胚胎期的发育调控,而且对蚕丝蛋白的合成也有至关重要的调控作用,然而当前对其性质和结构了解不多。为研究其性质、结构和生物学功能,构建了NusA、MBP、SUMO、Trx和His融合标签的Bmsage重组原核表达载体,通过改变诱导温度和IPTG浓度,确定了Bmsage在大肠杆菌中可溶性表达的最佳载体和表达条件,进而通过镍柱亲和层析纯化获得了Bmsage,利用圆二色光谱研究了其二级结构。结果表明,NusA与MBP标签可显著增强Bmsage在大肠杆菌中的可溶性表达,但难以与Bmsage分离。SUMO标签有一定的助溶效果,并且能够与Bmsage有效分离。其他标签对Bmsage可溶性表达的效果不明显。圆二色光谱分析表明Bmsage含有α-helix结构,推测SUMO标签可能促进了Bmsage折叠形成类天然的结构。这些工作为深入研究Bmsage的性质、结构与功能建立了基础,同时也为其他类似蛋白的表达纯化提供了参考。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART, 多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号: XM_038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域,而与β-catenin结合的N末端CTNNB1结构域部分氨基酸残基发生变异。组织表达谱显示,Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫中肠、血淋巴和性腺中的相对表达水平较高,在头、体壁、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管中的相对表达水平较低。【结论】本研究克隆了家蚕Pangolin X3,分析了其序列和表达特征,为深入研究家蚕Pangolin的生物学功能提供了基础。     

家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。     

家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析

精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列,分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构,其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30℃,最适pH为7.5。25℃时BmAK的催化活性最大,在15–30℃范围内,BmAK的结构相对稳定,活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础,有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。