同时放化疗敏感性不同宫颈癌组织的二维电泳图谱建立及质谱分析

目的:分析同时放化疗后高敏感和低敏感中晚期宫颈癌组织之间蛋白质组的差异,为确定宫颈癌同时放化疗敏感性相关蛋白提供依据。方法:收集治疗前的中晚期宫颈癌活检组织标本,均为中分化鳞癌,置于—80℃超低温冰箱保存。同时放化疗后,根据WHO实体瘤疗效判断标准,将收集的10例宫颈癌组织标本分为高敏感组(5例)和低敏感组(5例);提取组织总蛋白,进行双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)得到凝胶图谱,采用PD-quest 7.0软件进行匹配和差异分析,识别两组之间表达差异蛋白点。将部分差异蛋白点进行胶内原位酶解后进行MALDI-TOF-MS分析,获取肽质量指纹图,数据库搜索鉴定蛋白质。结果:建立了分辨率高,重复性好的同时放化疗后宫颈癌组织高敏感组和低敏感组的双向凝胶电泳图谱。高敏感组蛋白点数为781±74个,低敏感组蛋白点数为766±52个,组间平均匹配率为87.6%。质谱分析成功鉴定15个差异表达蛋白,其中7个蛋白质在高敏感组高表达,8个蛋白质在高敏感组低表达。结论:蛋白质2-DE图谱和质谱鉴定结果说明同时放化疗后高敏感组和低敏感组宫颈癌组织间存在蛋白质表达的差异,这些蛋白质可能与同时放化疗敏感性有关。     

采用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞的甲基化沉默基因

为筛选鼻咽癌的甲基化沉默基因,采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-dC)处理与未处理鼻咽癌细胞5-8F的蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.然后采用Western blotting和RT-PCR检测差异蛋白质nm23-H1在药物处理与未处理5.8F细胞中的表达水平,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测nm23-H1基因在药物处理与未处理5-8F细胞中的甲基化水平.建立了5-aza-2-dC处理与未处理5.8F细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了49个差异表达的蛋白质点,鉴定了33个差异表达的蛋白质,其中包括rim23.H1在内的15个蛋白质在5-aza-2-dC处理后的5-8F细胞中表达上调,而18个蛋白质表达下调.Western blotting和RT-PCR结果显示,nm23-H1在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后表达上调,MS-PCR结果显示,在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后nm23-H1基因甲基化水平下降,结果证实,nm23-H1基因是5-8F细胞中的甲基化沉默基因.15个5-aza.2-dC处理后表达上调的基因可能是5-8F细胞中的甲基化沉默基因,为筛选鼻咽癌甲基化失活基因提供了科学依据.     

初探Septin 9作为大B细胞淋巴瘤化疗敏感性相关标志物

目的：初步探讨Septin 9作为大B细胞淋巴瘤化疗敏感性相关标志物的实验依据。方法：通过肿瘤药物敏感试验选取化疗高敏感性和低敏感性大B细胞淋巴瘤组织,进行蛋白质组学比较研究后得出差异表达蛋白;对在低敏感组中高表达的Septin 9进一步行Western Blot验证,应用免疫组化技术检测Septin 9在临床病例中的表达情况。结果：化疗高敏感性和低敏感性大B细胞淋巴瘤组织蛋白质组学比较研究显示Septin 9蛋白在高敏感组表达低于低敏感组,免疫印迹和免疫组化结果与蛋白质组结果是一致的。结论：Septin 9蛋白表达在化疗敏感性不同大B细胞淋巴瘤中存在差别,存在化疗敏感性越高Septin 9表达越低的趋势,可能作为预测淋巴瘤化疗敏感性的候选标志物。     

幽门螺杆菌毒素蛋白CagA诱导的蛋白的差异表达分析及其基因在胃癌组织中的表达

为了研究胃癌细胞中幽门螺杆菌(Hp)毒素蛋白CagA诱导的蛋白差异表达及其基因在人胃癌组织中的表达,用Hp感染胃癌细胞系SGC 7901和AGS及用含CagA基因的表达载体稳定转染SGC 7901细胞, 构建3组实验模型.提取各组细胞的总蛋白进行双向凝胶电泳,筛选3组重叠的差异表达蛋白质斑点进行质谱鉴定.共获得135个差异表达的蛋白质,其中上调蛋白质73个,下调蛋白质62个. 鉴定出10个差异表达蛋白质, 其中有6个差异表达蛋白是首次发现,它们主要参与细胞的能量代谢和信号转导等.最后定量检测了这10个差异表达蛋白基因在人胃癌组织中的表达, 发现有4个基因高表达和1个基因低表达. 本结果将为研究幽门螺杆菌感染引起胃癌的分子机制提供新的线索.     

LCM纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽间质的定量蛋白质组学研究

间质在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视．为寻找与鼻咽癌( nasopharyngeal carcinoma,NPC )发生发展相关的特异性间质蛋白,采用激光捕获显微切割技术( laser capture microdissection,LCM )纯化鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜间质,荧光差异双向凝胶电泳( fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis 2-D,DIGE )结合质谱技术分离鉴定间质相关蛋白．Western blot及免疫组织化学技术验证了其中3个差异蛋白(CapG、L-plastin和S100A9),证实了2D-DIGE结果的可靠性．建立了LCM 纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽间质的荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤发生相关的间质蛋白,共得到34个有统计学意义的蛋白质点,质谱鉴定得到20个差异蛋白．研究结果提示：这些差异表达的蛋白质将有助于阐明鼻咽癌细胞和周围间质的关系．对间质蛋白功能的进一步研究,将有助于解析间质在肿瘤发生中的作用机制,并为从间质途径寻找肿瘤治疗靶标提供新思路．     

蛋白组学研究抗菌肽对BEL-7402细胞的作用

目的:采用蛋白组学研究家蝇抗菌肽cecropin对人肝癌BEL-7402细胞蛋白的影响,从蛋白质水平探讨抗菌肽抗肿瘤机制.方法:在测定肿瘤细胞生长指数的基础上,通过双向凝胶电泳分离差异蛋白,银染后进行图像分析,对表达差异2倍以上蛋白质点进行胶内酶解和MALDI-TOF-MS检测,获得肽质量指纹谱,应用Mascot搜索引擎在NCBI nr数据库中进行检索鉴定.结果:家蝇抗菌肽cecropin能够抑制BEL-7402细胞的生长,与对照组比较,抗菌肽处理组双向凝胶电泳共答定出12个差异表达蛋白点(上调蛋白6个,下调蛋白6个),大部分与细胞凋亡、细胞代谢、基因转录以及细胞骨架等相关.结论:这为深入研究抗菌肽抗肿瘤机制打下了基础.     

应用二维电泳和质谱技术初步研究NAG7基因的功能

为了进一步研究鼻咽癌相关基因NAG7的功能,NAG7基因编码框的cDNA片段被亚克隆至pcDNA3.1( )的表达载体,通过脂质体转染入鼻咽癌细胞系HNE1。抽提HNE1细胞和已转染了NAG7基因的HNE1细胞总蛋白质,用二维凝胶电泳分离蛋白质,获得二维凝胶图谱,PDQuest软件包分析后,确立表达上调的蛋白质斑点进行质谱分析,得到的肽质指纹经蛋白质数据库分析鉴定蛋白质。共分析了12个蛋白质点,其中3个未有质谱结果,已鉴定的9个蛋白质包括生长捕获特异蛋白、DNA结合蛋白、c-myc启动子结合蛋白及胱冬肽酶（caspase)6等蛋白质。通过对这些蛋白质性质和功能的讨论,发现它们参与了细胞周期调控、转录调节及细胞凋亡等重要事件。因此,VAG7很可能是通过介导上述蛋白质的表达上调而发挥作用。     

RKIP低表达与鼻咽癌侵袭转移和NF-κB信号通路活化相关

为筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)发病相关的蛋白质,采用双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)和质谱(mass spectrometry,MS)技术比较NPC组织与癌旁正常鼻咽上皮组织(adjacent normal nasopharyngeal epithelial tissue,ANNET)蛋白质表达的差异,鉴定了21个差异蛋白,其中Raf 激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)等9个蛋白质在NPC组织中的表达水平低于ANNET．为探讨RKIP在NPC转移中的作用和机制,采用Western blot检测RKIP在不同转移潜能的5-8F和6-10B NPC细胞中的表达水平,采用免疫组化方法检查RKIP在石蜡包埋NPC组织、正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET))及颈淋巴结转移NPC组织(lymphnode metastatic NPC,LMNPC)中的表达水平,采用脂质体转染方法将正义、反义RKIP表达质粒及其相应空白载体分别转染5-8F和6-10B细胞,建立相应的稳定转染细胞系,分析RKIP表达水平改变对NPC细胞体外侵袭能力和NF-κB信号通路活性的影响．结果显示：RKIP在高转移5-8F细胞中的表达水平低于非转移6-10B细胞、在NPC组织中的表达水平低于NNET、在转移癌中表达缺失．上调RKIP表达能抑制5-8F细胞的侵袭能力,而下调RKIP表达能增强6-10B细胞的侵袭能力;上调RKIP表达能降低5-8F细胞的p-IκB-α水平和NF-κB的转录活性,而下调RKIP表达能增加6-10B细胞的p-IκB-α水平和NF-κB的转录活性．研究结果提示,RKIP 可能是NPC的一个转移抑制蛋白,RKIP表达下调可能通过活化NF-κB信号通路促进NPC细胞侵袭和转移．     

PDIA1 和EF1D 在左侧和右侧结肠癌差异表达的实验研究

目的:初步确定蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1-delta为左侧和右侧结肠癌中差异表达蛋白,为左侧和右侧结肠癌在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据。方法:收集人左侧结肠癌(LSCC)和右侧结肠癌(RSCC)组织标本,进行二维凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定左右侧结肠癌中差异表达蛋白质,进一步应用RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学技术检测蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1-delta在左侧和右侧结肠癌中的表达状态。结果:筛选并成功鉴定出左侧和右侧结肠癌中16种差异表达蛋白质,与右侧结肠癌比较,10种蛋白在左侧结肠癌表达上调,6种蛋白在左侧结肠癌表达下调,其中蛋白质二硫化异构酶A1在左侧结肠癌中表达上调,延伸因子1-delta在左侧结肠癌中表达下调,并通过RT-PCR、Western Blot和免疫组化方法证实了在左侧和右侧结肠癌中该两种蛋白表达的差异,与蛋白质组学结果一致。结论:左侧结肠癌和右侧结肠癌的蛋白质组存在差异,其中蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1-delta在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是左侧和右侧结肠癌生物学行为差异的原因。     

鼻咽癌细胞系与永生化的鼻咽上皮细胞系蛋白质表达差异分析

鼻咽癌对我国南部居民的健康造成严重的威胁.为了研究鼻咽癌的发病机理,本研究采用了蛋白质组学技术分析和比较了鼻咽癌细胞系（HNE1和CNE1）与永生化的鼻咽上皮细胞系的蛋白质表达谱.采用双向凝胶电泳分离提取的全细胞蛋白质,通过PDQuest软件分析找出在肿瘤中表达变化的蛋白质点,用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(MALDI- TOF/TOF-MS)进行鉴定.共得到了15个在肿瘤细胞系中表达上调和18个在肿瘤细胞系中表达下调的蛋白质,并对其中一些蛋白质的表达进行免疫印迹的验证.这些表达差异的蛋白质与细胞的增殖和调亡、癌症的转移,细胞骨架,信号传导等有关.本研究鉴定了一批可能作为鼻咽癌治疗的药物靶标的蛋白质,并对研究鼻咽癌发病机理提供了相关的线索.     

Ezrin在化疗敏感性不同大B细胞淋巴瘤中表达的实验研究

目的：比较化疗敏感性不同弥漫性大B细胞淋巴瘤的蛋白质表达差异,寻找可反映大B细胞淋巴瘤化疗敏感性的标志物。方法：通过肿瘤药物敏感试验选取化疗高敏感性和低敏感性大B细胞淋巴瘤组织,进行蛋白质组学比较研究后得出差异表达蛋白;对在高敏感组中高表达的埃兹蛋白（Ezrin）进一步行免疫印迹验证,应用免疫组化技术检测在临床病例中的表达情况。结果：建立了化疗高敏感和低敏感大B细胞淋巴瘤差异表达蛋白质凝胶2D图谱,鉴定了28种差异表达蛋白,发现Ezrin蛋白在化疗高敏感组表达高于低敏感组,免疫印迹和免疫组化结果也进一步证实了Ezrin的这一表达状态。结论：Ezrin蛋白表达在化疗敏感性不同大B细胞淋巴瘤中存在差别,可能作为预测淋巴瘤化疗敏感性的候选标志物。     

Proteomic analysis of infiltrating ductal carcinoma tissues by coupled 2-D DIGE/MS/MS analysis

There is a growing interest in protein expression profiling aiming to identify novel diagnostic markers in breast cancer. Proteomic approaches such as two-dimensional differential gel electrophoresis coupled with tandem mass spectrometry analysis (2-D DIGE/MS/MS) have been used successfully for the identification of candidate biomarkers for screening, diagnosis, prognosis and monitoring of treatment response in various types of cancer. Identifying previously unknown proteins of potential clinical relevance will ultimately help in reaching effective ways to manage the disease. We analyzed breast cancer tissues from five tumor and five normal tissue samples from ten breast cancer subjects with infiltrating ductal carcinoma (IDC) by 2-D DIGE using two types of immobilized pH gradient (IPG) strips: pH 3-10 and pH 4-7. From all the spots detected, differentially expressed (p < 0.05 and ratio > 2) were 50 spots. Of these, 39 proteins were successfully identified by MS, representing 29 different proteins. Ten proteins were overexpressed in the tumor samples. The 2-D DIGE/MS/MS analysis revealed an increase in the expression levels in tumor samples of several proteins not previously associated with breast cancer, such as: macrophage-capping protein (CAPG), phosphomannomutase 2 (PMM2), ATPase ASN1, methylthioribose-1-phosphate isomerase (MRI1), peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4, cellular retinoic acid-binding protein 2 (CRABP2), lamin B1 and keratin, type II cytoskeletal 8 (KRT8). Ingenuity Pathway Analysis (IPA) revealed highly significant (p = 10(-26)) interactions between the identified proteins and their association with cancer. These proteins are involved in many diverse pathways and have established roles in cellular metabolism. It remains the goal of future work to test the suitability of the identified proteins in samples of larger and independent patient groups.     

Proteome profiling of Epstein-Barr virus infected nasopharyngeal carcinoma cell line: identification of potential biomarkers by comparative iTRAQ-coupled 2D LC/MS-MS analysis

Epstein-Barr virus (EBV) has been implicated in the development of nasopharyngeal carcinoma (NPC), a squamous cell carcinoma with high-occurrence in Southeast Asia and southern China. However, the underlying relationship of EBV and NPC squamous cell remains obscure. In this study, we employ a comparative iTRAQ-coupled 2D LC-MS/MS system to analyze the protein profile of NPC cell line upon EBV infection. Based on the proteome data and Western blot validation, 12 proteins were found to be significantly up-regulated and associated with signal transduction, cytoskeleton formation, metabolic pathways and DNA bindings. The interactions among NPC and EBV proteins were further analyzed and protein networks were established. Based on the functions of differentially expressed proteins, a metabolic pathway was proposed to elucidate their relationship in cytoskeleton formation, cell proliferation and apoptosis. Our results suggested a new proteome platform to analyze EBV's role in NPC squamous cell line. And these differentially expressed proteins may hold the promise as potential biomarkers for NPC diagnostics and treatment.     

鼻咽癌5-8F细胞膜蛋白质组初步分析

细胞膜蛋白是细胞的重要组成部分,作为细胞的"门铃"与"门户",参与细胞内外物质交换、信息转换、细胞生长发育、细胞迁移以及免疫应答等重要生理活动.为鉴定鼻咽癌转移相关膜蛋白,运用差速离心联合双水相方法分离纯化鼻咽癌高转移细胞5-8F的细胞膜,SDS-PAGE分离膜蛋白,液相色谱/电喷雾串联质谱分析(LC-MS/MS)结合生物信息学分析鉴定出316种非冗余蛋白质,其中152种(48.5%)被注释为膜蛋白或膜相关蛋白.通过肿瘤差异蛋白质组数据库(dbDEPD)搜索,发现在114个膜蛋白中有49种膜蛋白与其它肿瘤的发生发展密切相关,其中21个膜蛋白与肿瘤转移相关.进一步分析发现膜蛋白CD104、VDAC2、CD298和SLC25A3与同属头颈部肿瘤的口腔癌转移相关,提示这4个膜蛋白也可能是鼻咽癌潜在的转移相关蛋白.研究结果提供了一个鼻咽癌细胞5-8F包含中高丰度膜蛋白的数据库,为进一步研究头颈部肿瘤鼻咽癌癌变分子机理积累了有价值的资料.     

Survivin特异性SiRNA提高鼻咽癌移植瘤放射敏感性

目的：研究Survivin特异性SiRNA（small interfering RNA）对鼻咽癌移植瘤的放疗增敏作用,探索提高鼻咽癌疗效的新方法。方法：Survivin特异性SiRNA转染鼻咽癌5-8F细胞系,培养48h后,采用RT-PCR、流式细胞仪（flow cytometry,FCM）分别检测Survivin mRNA和蛋白在5-8F细胞中表达。将Survivin基因特异性SiRNA转染5-8F细胞,培养24h后,用剂量为6GY的放射线处理,培养6h后,收集细胞,进行裸鼠皮下接种,50d后处死裸鼠,对移植瘤进行分析。结果：Survivin特异性SiRNA能有效抑制5-8F细胞中Survivin表达。Survivin特异性SiRNA组,Survivin表达阳性率12.37&#177;1.86%,与对照组阳性率91.93&#177;1.3%和阴性对照组阳性率92.43&#177;2.34%比较,差别具有显著性（p〈0.01）。特异性SiRNA加放射组移植瘤（0.03&#177;0.03g）显著小于特异性SiRNA组（0.28&#177;0.02g,p〈0.01）与阴性SiRNA加放射组（0.17&#177;0.02g,p〈0.01）。结论：Survivin特异性SiRNA增强了鼻咽癌5-8F细胞移植瘤的放射敏感性。     

Quantitative proteomic analysis of differential proteins in the stroma of nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharyngeal epithelial tissue

The importance of stromal cells and the factors that they expressed during cancer initiation and progression have been highlighted by recent literature. To identify the stromal proteins involved in nasopharyngeal carcinoma (NPC) carcinogenesis, we assessed differences in protein expression of the stroma from NPC and normal nasopharyngeal epithelium tissues (NNET) using a quantitative proteomic approach combined with laser capture microdissection (LCM). LCM was performed to purify stromal cells from the NPC and NNET, respectively. The differential proteins between the pooled microdissected tumor and normal stroma were analyzed by two‐dimensional difference gel electrophoresis (2D‐DIGE) combined with mass spectrometry (MS). Twenty differential proteins were identified, and the expression and location of two differential proteins (L ‐plastin and S100A9) were further confirmed by Western blotting and immunohistochemical analysis. Our results will be helpful to study the role of stroma in the NPC carcinogenesis, as well as discover the interaction between NPC cells and their surrounding microenvironment. J. Cell. Biochem. 106: 570–579, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

宫颈腺癌发生相关蛋白的蛋白质组学初步研究

目的：为了研究宫颈腺癌和正常宫颈组织的差异表达蛋白,为宫颈腺癌的发生和早期诊断提供有意义的生物标志物。方法：以正常宫颈组织和宫颈腺癌组织为研究对象,提取组织总蛋白,依次进行二维凝胶电泳,凝胶图象分析,基质辅助激光解吸附／离子化飞行时间质谱及生物信息学分析。Western Blot方法验证部分蛋白表达情况。结果：建立了宫颈腺癌和正常宫颈组织的二维电泳图谱,进行质谱和生物信息学分析比较鉴定宫颈腺癌和正常宫颈组织差异表达蛋白7个,与正常宫颈组织比较,宫颈腺癌表达降低的蛋白有3个,包括抑制素（inhibin-beta）,PTEN,乳铁蛋白（lactoferrin）;宫颈腺癌表达升高的蛋白有4个,包括谷胱甘肽S-转移酶（GSTT1＊0）,Homeodomain—interacting protein kinase2（HIPK2）,CD44v5,galectin-7。Western Blot方法检测结果显示inhibin-beta和PTEN在宫颈腺癌中表达变化情况与蛋白质组学结果一致。结论：宫颈腺癌和正常宫颈组织存在差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能是宫颈腺癌发生相关蛋白,可能作为宫颈腺癌早期诊断的标志物。     

Proteomic analysis of colonic mucosa in a rat model of irritable bowel syndrome

Irritable bowel syndrome (IBS) is one of the most common functional disorders of the gastrointestinal tract. It is characterized by abdominal pain and changes in bowel habits. Various studies have investigated the pathophysiologic processes underlying IBS, but the mechanism remains poorly understood. In the present study, we established an IBS model and identified differentially expressed proteins in colon tissue of IBS rats compared with healthy controls by 2‐D gel electrophoresis, MALDI‐TOF‐MS, and Western blot analysis. Our results showed that 13 of the 1396 protein spots on 2‐D gel were differently expressed between the IBS and control groups. Ontological analysis of these proteins revealed primary roles in catalytic activity (protein disulfide‐isomerase A3, glyoxalase I, cathepsin S, α‐enolase), structural support (cytokeratin 8), antioxidant activity (peroxiredoxin‐6), protein binding (transgelin, serpin peptidase inhibitor B5), and signal transduction (40S ribosomal protein SA). Protein disulfide‐isomerase A3 and cytokeratin 8 overexpression in IBS were confirmed by Western blot. The findings indicate that multiple proteins are involved in IBS processes that influence intestinal tract immunity, inflammation, and nerve regulation. Our study provides useful candidate genes and proteins for further investigation.