鼻咽癌相关基因NGX6对鼻咽癌细胞周期的影响

为了探讨鼻咽癌（NPC）候选抑瘤基因NGX6对NPC细胞的细胞周期进程及细胞周期素的影响,阐明它的作用机制,通过建立稳定表达NGX6的鼻咽癌HNE1细胞株,采用细胞免疫组织化学,流式细胞仪检测与分析细胞周期及细胞周期素的改变,用western blot验证它对细胞周期的影响。结果显示稳定表达NGX6的HNE1细胞较对照组细胞周期中G0/G1期比值明显增加,而S期比例减少。细胞凋亡率无明显变化。流式细胞仪检测发现cyclinD1、A和E的表达明显减少,以cyclinD1的改变最为明显。Western blot检测也发现cyclinD1的表达明显下调。以上结果说明NGX6主要通过下调cyclinD1的表达,延缓细胞周期的G1→S的进程,从而抑制NPC细胞的过度增殖。     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的IgC2结构域蛋白的原核表达和纯化

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4基因是新克隆的脑瘤相关基因,采用多聚酶链式反应（PCR）方法获得长约500bp含IgC2结构域的DNA序列,扩增产物克隆至pGEX-4T-2质粒中,构建GST融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经包涵体沉淀,溶解,Glutathione-Sepharose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blot鉴定证实,通过IgC2结构域蛋白的纯化分离该结构域,为进一步研究该结构域及LRRC4基因的结构和功能奠定了基础。     

抑瘤基因NGX6对鼻咽癌细胞株HNE1细胞生长的影响(英文)

鼻咽癌是我国南方多发恶性肿瘤 ,它的发生发展与遗传因素密切相关 .采用定位候选克隆策略在 9p上克隆出一个候选抑瘤基因 ,命名为NGX6 .为了进一步研究它的功能 ,将NGX6基因的全长cDNA片段亚克隆至pcDNA3.1(+ )的表达载体中 ,通过脂质体转染入鼻咽癌细胞系HNE1中 ,Northern杂交方法筛选高效表达NGX6的细胞株 ,并借助细胞生长曲线、软琼脂糖集落形成实验、裸鼠体内接种实验和流式细胞仪对转染细胞的生物学行为进行了检测 .结果显示 ,转染了NGX6基因的HNE1细胞的生长速度明显减慢 ,在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降 (P〈0 0 5 ) ,裸鼠体内成瘤的时间较对照组明显延长 ,瘤体的大小和重量较对照组明显减少 ,流式细胞仪检测发现细胞的凋亡率无明显变化 .为了明确NGX6蛋白在细胞中发挥作用的部位 ,进一步将NGX6的开放阅读框架完整正确地克隆到pEGFPC1的荧光载体中 ,转染到COS7细胞中 ,用荧光显微镜观察细胞中荧光的分布 ,发现荧光主要分布在细胞浆中 ,说明NGX6蛋白可能是一种胞浆蛋白 .该研究表明 ,NGX6在NPC的发生发展中起重要作用 ,为全面阐述NGX6的功能提供重要的信息 ,为进一步的功能研究打下基础     

NAG7基因转染HNE1细胞后下调蛋白质的鉴定及其意义(英文)

NAG7基因是我室克隆的与鼻咽癌相关的肿瘤抑制候选基因 .将NAG7编码框的cDNA片段克隆至pGEM3.1(+ )的表达载体 ,经脂质体转染入HNE1细胞 ,经G4 18筛选 ,并运用PCR技术证实 .建立含NAG7基因稳定转染的细胞系 ,抽提细胞总蛋白质 ,双向凝胶电泳分离蛋白质 ,对表达下调的蛋白质点进行质谱分析 ,获得的肽质指纹经SWISS PROT数据库分析以鉴定蛋白质点 .鉴定出的 7个下调蛋白质包括纤溶酶原、收缩蛋白、Ras 相关蛋白Rab 36及ARF 相关蛋白等 .通过对蛋白质性质和功能的分析 ,发现这些蛋白质参与了细胞信号的转导、蛋白质的转运及细胞代谢等众多事件 .因此 ,NAG7基因很可能是通过介导这些蛋白质的表达下调而发挥其功能     

一种新型细胞微阵列的制作和应用

为了高通量地检测大量培养细胞中基因原位表达, 发明了一种制作细胞微阵列的新方法,成功地制作含20种细胞系共100个供体细胞石蜡混合物点阵的细胞微阵列.免疫组化检测P53, P21, PTEN、P16基因在细胞微阵列中的蛋白质表达.原位杂交检测BRD7、NGX6 基因在细胞微阵列中mRNA原位表达.建立了P53、P21、PTEN、P16蛋白和BRD7、NGX6 mRNA 在不同培养细胞中的原位表达谱.细胞微阵列为基因功能研究提供一种新的高通量工具.细胞微阵列可广泛用于DNA、RNA和蛋白质水平上的基因原位表达研究.细胞微阵列还可用于筛选药物作用靶标的研究.     

一种组织微阵列供体取样与受体蜡块制作的 新器具和新方法

发明一种组织微阵列供体取样与受体蜡块制作的新器具和新方法 . 利用这种新器具和新方法成功地制作了分别含 448 和 390 个供体组织点阵的组织微阵列受体蜡块和切片 . 这种新方法制作的组织微阵列切片经 H&E 染色,显微镜下观察证实,所有切片均无供体点阵组织脱落,切片厚度适中,组织结构无挤压变形,细胞形态均匀一致 . 免疫组化检测 P53 和 P16 蛋白在组织微阵列切片与其相应的常规组织切片中的表达结果完全一致 . 这种组织微阵列供体取样与受体蜡块制作新器具和新方法成本低廉,操作简便,具有在实验室推广应用的价值 .     

LRRC4融合蛋白的构建与表达研究

在前期工作中,采用EST介导的定位候选克隆策略,克隆了一个在脑瘤中表达下调的脑特异表达新基因LRRC4,为进一步研究其结构与功能的关系,构建了含LRRC4基因全长编码区的pGEM-T Easy质粒,在此基础上通过亚克隆构建了LRRC4融合蛋白的绿色荧光蛋白（pEGFP-C1）表达质粒,瞬时转染哺乳动物细胞,结果发现表达的LRRC4融合蛋白定位于活细胞的细胞膜上.同时,构建了LRRC4全长和截短型原核表达pGEX-4T-2质粒,成功而高效地在大肠杆菌BL21 中表达LRRC4融合蛋白.上述工作为制备多抗,深入研究LRRC4基因的功能奠定了基础.     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的克隆与在脑瘤中的表达分析

在染色体7q31-32多种肿瘤杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）高频区,采用表达序列标签（expressed sequence tag,EST）介导的定位候选克隆策略获得了一个定位于人染色体7q31-32的新基因（GenBank 登录号: AF196976）.该基因编码653个氨基酸,蛋白质理论pI/m:6.58/72.7 ku.它包含七个典型的LRR、一个IgC2样结构域.此外,它还包含一个N端信号肽、一个C端跨膜区.其结构特征表明它是富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR）超家族的新成员.经过人类基因组命名委员会的同意,将该基因命名为LRRC4.此外,通过序列相似性匹配还获得了定位于小鼠6号染色体的LRRC4的同源基因（GenBank 登录号: AF290542）.RNA印迹和RT-PCR检测发现LRRC4在正常人脑组织相对特异表达,而在多种原发性脑瘤表达明显下调或缺失.综合考虑LRRC4基因的序列特征及表达谱,提示LRRC4基因可能在神经系统中发挥重要作用.     

鼻咽癌相关基因NAG7编码产物的表达和定位分析

为了研究NAG7基因编码产物的特性和在活细胞内定位与表达,首先利用生物信息学分析NAG7编码蛋白的一般性质并预测其定位,再通过构建增强型绿色荧光蛋白（Enhance green fluorescent protein,EGFP)与NAG7融合基因的真核表达载体pEGFP-C2-NAG7,通过脂质体介导分别转染非洲绿猴肾细胞系COS7和人鼻咽癌细胞系HNE1,瞬时表达后荧光显微镜观察NAG7基因编码蛋白的活细胞内定位及表达,研究结果表明NAG7的编码产物可以COS7细胞中高表达并定位于细胞浆,而在HNE1细胞中虽也定位于胸浆,但仅有极少数细胞存在表达,因此NAG7编码产物在HNE1中的表达差异是否是NPC发生的原因之一有待深入研究。     

用双向电泳和质谱技术检测NGX6转染后人鼻咽癌细胞表达差异的蛋白质(英)

NGX6是克隆的鼻咽癌相关基因,它的功能与作用机制目前尚不十分清楚.通过脂质体转染把NGX6导入鼻咽癌细胞株中,采用双向凝胶电泳分离细胞内所有蛋白质,通过软件分析,找到与未处理细胞表达差异的蛋白质,通过质谱分析和生物信息学资料处理.鉴定出七种表达上调的蛋白质,其中包括Fas蛋白,锌指蛋白（ZNF）,主要组织相容性抗原Ⅱ（MHCⅡ）等.Fas蛋白参与细胞凋亡的信号传导途径,它的上调可以促进细胞凋亡;ZNF蛋白参与基因的转录调控,它的上调也可影响细胞异常增殖的信号传导通路;MHCⅡ可以促进机体对肿瘤细胞的免疫应答.这些结果说明NGX6可能通过多种途径抑制鼻咽癌细胞的生长,为研究NGX6的作用机制提供了很好的实验资料,对鼻咽癌的基因治疗奠定了一定的研究基础,也为研究其他基因的作用机制提供了新思路.